老年吸烟者肺癌H-ras基因突变的研究

中华老年医学杂志 1999年第3期第18卷 临床研究

作者：应可净　刘富光　张行　黄刚　王选锭　周学莉

单位：310009 杭州市，浙江大学附属第二医院呼吸内科〔应可净(现在310016 杭州市，浙江大学附属邵逸夫医院呼吸内科)、刘富光、张行、黄刚、王选锭、周学莉〕

　　关键词： 肺肿瘤；基因,ras；吸烟

　　【摘要】　目的　探讨老年吸烟者肺癌H-ras基因变化的意义。　方法　对33例吸烟肺癌和22例不吸烟肺癌患者采用纤维支气管镜毛刷刷取支气管脱落细胞，应用PCR-RFLP方法进行H-ras基因突变检测。　结果　肺癌中H-ras基因总突变率为52.7%(29/55)，其中吸烟组肺癌H-ras基因突变率为66.7%，不吸烟组肺癌为31.8%，二者差异有显著性(P＜0.05)，吸烟组肺鳞癌患者H-ras基因突变率为70.0%，明显高于不吸烟组肺鳞癌患者的16.7%(P＜0.05)。　结论　提示H-ras基因可能是被烟草激活的一个特殊位点，吸烟是导致H-ras基因突变的重要因素。

Detection of H-ras oncogene mutation in elderly smokers with lung cancers

YING Kejing, LIU Fuguang, ZHANG Xing, et al. The Second Affiliated Hospital, Zhejiang University, Hangzhou 310009

　　【Abstract】　Objective　To study the relationship between the H-ras oncogene and lung cancers in elderly smokers.　Methods　The samples were collected from 55 consecutive patients with tissue diagnosed lung cancers by fiberoptic bronchoscopic brushing. Mutation in coden 12 of H-ras oncogene was detected in the exfoliated cells using PCR-RFLP method (polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphisms).　Results　H-ras oncogene mutation was present in 52.7%(29/55)of total patients with 70.0%(23/33) of smokers and 31.8%(7/22) of nonsmokers (P＜0.01).Subgroup analysis showed that H-ras oncogene mutation was present in 75.0%(15/20) of smokers with squamous cell lung cancer as compared to only 16.7%(1/6) of nonsmokers with squamous cell lung cancer (P＞0.05).　Conclusions　Our results suggest that coden 12 of the H-ras oncogene may be a specific target for the mutagenic activation by tobacco smoke, and smoking is an important factor in the induction of H-ras oncogene mutation.

　　【Key words】　Lung neoplasms Genes,ras Smoking

　　最近的分子生物学研究揭示，人类癌症的发生与多种原癌基因活化和抑癌基因失活有关。肺癌的发生与ras基因激活关系最为密切，另外也与一些化学污染物、生活行为、物理因素和机体易感性有关，其中吸烟是公认的诱发肺癌的首要原因。

　　对吸烟者肺癌中ras基因突变国外有较多的研究，但国内研究较少。我们采用纤维支气管镜(纤支镜)直视下毛刷刷取病灶脱落细胞，并用PCR-RFLP方法(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphisms)检测了33例吸烟肺癌和22例不吸烟肺癌患者支气管上皮脱落细胞中H-ras基因第12密码子的突变情况，以探讨吸烟相关肺癌与H-ras基因突变的内在联系。

　　对象与方法

　　一、对象

　　55例肺癌患者均来自我院1995年8月至1996年12月门诊及住院患者，经细胞或组织病理检查证实为肺癌，年龄60～78岁，平均65.8岁。其中鳞癌26例，腺癌16例，小细胞未分化癌3例，肺透明细胞癌2例，未能分型的非小细胞肺癌(NSCLC)8例。吸烟组33例，男性25例，女性8例；不吸烟组22例，男性16例，女性6例。根据国际抗癌联盟肺癌(TNM)分期：Ⅰ期18例，Ⅱ期23例，Ⅲ～Ⅳ期14例。吸烟者吸烟指数均≥400年支。所有患者均经纤支镜检查、取材。

　　二、实验方法

　　1.脱落细胞的获得：对受检肺癌患者行常规纤支镜检查，在纤支镜直视下刷取病灶支气管标本，置于无菌生理盐水中送检，同时涂片送病理检查。

　　2.DNA抽提：脱落细胞离心沉淀弃上清液，加抽提液1 ml混匀，37℃ 1小时，加入蛋白酶K至终浓度为100 mg/L，50℃ 3小时。酚-氯仿抽提，乙醇沉淀，再加缓冲液TE重溶DNA，4℃保存^〔1〕。

　　3.脱落细胞DNA扩增：以H-ras基因第1外显子为目标进行扩增120 bp，PCR扩增引物上游序列为：5’-AGCGATGACGGAATATAAGCTG-3’，下游序列为：5’-CTCACCTCTATAGTGGGGTCG-3’。 PCR反应液体系共20 μl，94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸30秒，共35个循环。

　　4.限制性片段长度多态性(RFLP)分析：PCR产物15 μl，10×缓冲液2 μl，HpaⅡ酶1 μl，超纯水2 μl，混匀后置37℃ 3小时(PCR扩增引物、反应液、HpaⅡ酶均由上海中亚生物基因研究所提供)。用12%聚丙烯酰胺凝胶电泳2小时，经银染色15分钟，置入数字成像系统(IS-1000)，摄片行密度扫描，观察限制性DNA片段多态性变化。每次电泳均设置未突变型与突变型对照。

　　三、统计学处理：

　　采用χ²检验。

　　结　　果

　　未突变扩增产物形成40 bp和80 bp 2个片段，突变型由于12位密码子碱基变换以后酶切位点消失，仍为120 bp长度DNA片段。结果见图1和表1。吸烟组与不吸烟组比较，肺癌H-ras基因突变率差异有显著性(P＜0.05)。两组肺鳞癌H-ras基因突变率比较，差异有显著性(P＜0.05)。

1、2为阳性(均为肺癌患者)　4为阴性对照　5为标记　6为阳性对照

　　图1　PCR-RFLP法检测肺癌H-ras基因第12密码子

　　突变情况的聚丙烯酰胺电泳图

表1　吸烟组与不吸烟组不同病理类型肺癌H-ras基因突变的比较(例数)

注：(　)内数字为突变率；与不吸烟组比较，^*P＜0.05

　　讨　　论

　　有研究资料表明，吸烟是肺癌的重要危险因素，每年大约有300万人由于吸烟而死于肺癌，尤其是肺鳞癌和小细胞肺癌^〔2〕。在肺癌中，许多癌基因参与其发生、发展，尤以ras基因与myc基因与其关系最为密切。本组33例老年吸烟肺癌患者发生H-ras基因突变率明显高于非吸烟肺癌患者，表明长期吸烟与H-ras基因突变密切相关。烟草中含有3 800多种化学物质，主要是亚硝基化合物、多环芳香族化合物，其中某些物质可与DNA发生共价反应产生DNA加成物(DNA adducts)。Philips等^〔3〕利用³²P标记技术测出健康肺中与DNA共价结合的加成物，吸烟者比不吸烟者肺组织中的DNA加成物含量高，且其含量与每日香烟消耗量或终身香烟消耗量呈线性相关。已知DNA加成物是机体与环境(香烟)中的化学致癌因子相互作用的产物，它可引起细胞染色体的畸变，诱发肺癌的发生。Kabat^〔4〕研究认为吸烟者的每日吸烟量与肺癌的危险性有剂量效应关系。其中鳞癌、小细胞肺癌危险性高于腺癌、细支气管肺泡癌。本实验结果亦提示鳞癌H-ras基因突变率高于其他组。Rodenhuis等^〔5〕动物实验显示香烟中苯并芘能诱发ras基因突变，其结果与流行病学资料相吻合^〔6〕。Kennedy等^〔7〕研究发现重度吸烟者支气管上皮细胞有轻、中、重不同程度增生、鳞状上皮化生、核异形变以及原位癌，与肺癌的前期病变相似。

　　临床研究表明，肺癌患者ras基因的突变和吸烟史之间存在明显的相关性。张广宇等^〔8〕对26例男性肺癌患者K-ras基因突变分析发现，12例有长期吸烟史者中有11例存在K-ras基因第12密码子突变，突变率高达92%，而14例非吸烟者仅7例(50%)发生突变，两者差异有显著性(P＜0.05)。Westra等^〔9〕报道肺癌样本中ras基因突变率在经常吸烟组为30%，与非吸烟组的7%比较，差异有极显著性；并认为ras基因激活成为癌基因发生在肿瘤形成的多阶段的前期，甚至在肿瘤成型可辨别之前。

　　本组老年吸烟肺癌患者中，鳞癌占第1位，鳞癌的H-ras突变率也较腺癌高。刘祥麟等^〔10〕报道3例吸烟肺鳞癌患者标本组织DNA均使NIH/3T3细胞发生转化，并检出癌基因H-ras活化。Mitsudomi^〔11〕也认为在H-ras基因突变中肺鳞癌占较高比例。吸烟鳞癌组与不吸烟鳞癌组比较，H-ras基因突变差异有显著性。推测在肿瘤发生与致癌物质之间ras基因起着直接联系的作用。

　　本研究结果提示H-ras基因可能是烟草激活的一个特殊位点，吸烟可能是导致H-ras基因突变的重要因素。

　　参考文献

　　1　卢圣栋，主编.现代分子生物学实验技术.第1版.北京：高等教育出版社，1993.50-56.

　　2　Tong L, Spitz MR, Fueger JJ, et al. Lung carcinoma in former smokers. Cancer, 1996,78:1004-1010.

　　3　Philips DH, Hewer A, Martin CN, et al. Correlation of DNA adduct levels in human lung with cigarette smoking. Nature, 1988,336:790-792.

　　4　Kabat GC. Aspects of the epidemiology of lung cancer in smokers and nonsmokers in the United States. Lung Cancer, 1996,15:1-20.

　　5　Rodenhuis S, Slebos RJ. The ras oncogenes in human lung cancer. Am Rev Respir Dis, 1990,142(6 Pt 2):S27-S30.

　　6　Levi F, Franceschi S, Vecchia CL, et al. Lung carcinoma trends by histologic type in Vaud and Neuchatel, Switzerland, 1974-1994.Cancer,1997,79:906-914.

　　7　Kennedy TC, Proudfoot SP, Franklin WA, et al. Cytopath-ological analysis of sputum in patients with airflow obstruction and significant smoking. Cancer Res, 1996,56:4673-4678.

　　8　张广宇，孙以瑜，王孟山，等.肺癌K-ras基因突变的监测及临床应用.中华结核和呼吸杂志，1995，18：282-286.

　　9　Westra WH,Slebos RJ, Offerhaus GJ, et al. K-ras oncogene activation in lung adenocarcinomas from former smokers. Evidence that K-ras mutations are an early and irreversible event in the development of adenocarcinoma of the lung.Cancer, 1993,72:432-438.

　　10　刘祥麟，马洁羽，孔颂阳，等.吸烟者肺癌肿瘤ras癌基因活化的检测.肿瘤，1996，16：412-413.

　　11　Mitsudomi T. P53 gene mutations in non-small-cell lung cancer cell lines and their correlation with the presence of ras mutations and clinical features. Oncogene, 1992,7:171-172.

(收稿：1998-04-30　　修回：1999-01-12)