p53基因PCR-SSCP银染检查痰标本诊断肺癌
安徽医科大学学报 1999年第6期第34卷 临床医学研究
作者：操乐杰 李龙芸 郭子健 朱元珏
单位：操乐杰 安徽省立医院呼吸内科，合肥 230001；李龙芸 郭子健 朱元珏 中国医学科学院.中国协和医科大学.北京协和医院，北京 100730
关键词：肺肿瘤；诊断；痰；基因；p53；银染色法
摘要 目的 了解痰标本检测肺癌患者p53基因突变的可行性及其对临床诊断的意义。方法 采用改良Saccomanno法浓缩及保存痰标本，部分涂片找癌细胞，其余标本进行痰细胞DNA提取及多聚酶链反应(PCR)-单链构象多态性分析(SSCP)。共检测22例患者，其中确诊肺癌患者15例(涂片或活检找到癌细胞)，临床高度怀疑肺癌患者5例(涂片或活检均阴性)，2例非肿瘤患者(1例为结节病，另1为右中叶肺炎)，同时采用正常肺组织标本作对照。结果 p53外显子6、7、8的PCR-SSCP银染阳性率在肺癌组及癌疑组分别为6/15(40%)和2/5(40%)。非肿瘤患者痰标本及正常肺组织均未发现p53基因异常。结论 改良Saccomanno法不仅能贮存、浓缩痰细胞，而且方便痰标本DNA提取；PCR-SSCP银染方法可用来检测肺癌患者痰细胞的p53基因突变。
中国图书资料分类法分类号 R734.2
Detection of p53 gene mutation in preserved sputum
with PCR-SSCP for diagnosis of lung cancer
Cao Lejie1, Li Longyun2, Guo Zijian2 et al
(1Anhui Provincial Hospital, Hefei 230001;2Peking Union Medical Hospital,100730)
Abstract Objective To screen for p53 abnormalities of sputum samples in lung cancer patients and value in early diagnosis of lung cancer.Methods The modified Saccomannos concentration method was carried in preservd sputum samples and the polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism (PCR-SSCP) analysis was used for p53 gene investigation. By examining 22 sputum samples (15 from confirmed lung cancer patients, 5 from clinically suggestible lung cancer patients, 1 from sarcoidosis patient and 1 from right central pneumonia patient) and normal lung tissues as control.Results Ten samples from 22 patients had positive tumor cells and the mean DNA concentration of preserved sputum samples was (1.88±1.49) g·L-1, which OD260 nm/OD280 nm was 1.61(40%) preserved sputum specimens (6 from 15 confirmed lung cancer patients, 2 from 5 clinic suggestible lung cancer patients without pathological evidences) had been found p53 gene abnormalities. Two non-lung tumor sputum samples and 1 normal lung tissue had not been found any p53 gene abnormality.Conclusion The preserved sputum samples of the modified Saccomannos method is very important prearrangment for p53 gene investigation. PCR-SSCP analysis of sputum samples is successful in detection of p53 gene abonormalities of lung cancer patients and the p53 abnormalitis of clinical suggestible lung cancer without pathologic evidences indicate p53 abnormalitis earlier than other diagnostic method, which may serve as a early diagnosis method of lung cancer.
MeSH lung neoplasms; sputum; genes p53 mutation; sliver staining
近年来，肺癌发病率持续上升，已居国内部分大城市恶性肿瘤的首位，而致死率又居高不下，提高肺癌早期诊断率，增加手术成功率，降低死亡率成为国内外学者研究的热点。传统的痰细胞学检查及胸片普查并不能达到早期诊断、降低死亡率的目的〔1〕。p53基因是人类重要的抑癌基因，p53基因突变或缺失可引起生长失控形成肿瘤。肺癌具多基因异常，p53基因异常见于70%～90%小细胞肺癌及47%非小细胞肺癌，是常见、高发的基因异常〔2〕。而肺癌的发生存在一个形态局部变化、发展的过程。基因及免疫组化分析显示癌前气管病灶即出现p53基因突变。p53蛋白免疫组化染色显示p53蛋白累积在正常支气管粘膜0，鳞状化生7%，轻度不典型增生25%，原位癌57%，显微镜下侵犯癌70%，76%在全层侵犯癌；即25% p53基因点突变发生于极早期肿瘤，大部分突变亦在肿瘤侵犯进展期前出现，故早期痰液和纤支镜标本p53基因检测可能是早期诊断肺癌的重要途径〔3〕。聚合酶链-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)银染检查是常用的检测p53基因突变、缺失的方法〔4〕。我们通过PCR-SSCP银染检测肺癌患者、临床疑诊肺癌患者、非肿瘤患者痰标本及正常肺组织标本，以了解PCR-SSCP银染方法检测痰标本p53基因异常的可行性及对肺癌的诊断意义，寻求以p53基因检测早期诊断肺癌的理论依据。
1 材料与方法
1.1 痰标本收集与处理 采用Saccomano〔5〕法收集痰标本。用50 ml内壁硅化的离心管留痰。每管内盛含2%聚乙二醇及50%乙醇的固定液30 ml，给病人两管连续留2天痰液。病人咳痰前用生理盐水或凉开水清洁口咽部，弃去第一口痰，留取24 h的深部痰液5～10口。痰量少时可留2～3天痰液于1管，痰量多时可1天留2管。每咯一口痰于离心管内后立即盖紧盖子用力摇动试管以利固定。
收集的痰标本加入10%粘痰松解剂(协和医院自制)静置5 min，后再用力摇动至管底自然出现沉淀为止。1 500 r·min-1离心5 min，弃上清。将管底沉淀物用吸管轻轻抽吸，混匀后吸出3～4滴于玻片涂片染色，痰细胞学检查。剩下痰液转入1.5 ml Eppendorf管内予编号，保存于-20℃冰箱(短期保存)或-70℃冰箱(长期保存)备用。
1.2 正常肺组织 系安徽省立医院急性肺外伤手术标本。新鲜组织取出后置于液氮内，后贮存于-70℃冰箱。该患者术前无肺部疾患及嗜烟史。
1.3 DNA提取
1.3.1 痰标本DNA提取 贮痰标本5 000 r·min-1离心5 min,弃上清；加PBS 1 ml洗涤2次，5 000 r·min-1离心弃上清后加0.5 ml DNA提取液37℃温育1 h，加蛋白酶K 5～10 μl(20 g·L-1)50℃孵育4 h，经饱和酚、氯仿/异戊醇抽提，10 mol·L-1醋酸氨及预冷无水乙醇沉淀，再经70%乙醇漂洗2次，5 000 r·min-1离心，使沉淀下底移弃上清液，加TE 25～50 μl 4℃过夜后存于-20℃冰箱。
1.3.2 肺组织标本DNA提取 取组织块，剪碎后采用上述方法提取DNA。
1.4 PCR-SSCP银染法 1 μl痰DNA标本加入25 mmol·L-1 MgCl2 2 μl， 10×Buffer 2.5 μl Taq酶1 μl，2.5 mmol·L-1 dNTP 2.0 μl(前4种均为Promega公司产品)，外显子6～8引物2 μl(外显子左右各1 μl)，加去离子水至25 μl。经95℃预变性8 min后，于94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min共35个循环，后72℃延伸10 min。PCR产物于-20℃保存。PCR仪系美国ERICOMP Inc产品(TWINBLOCK SYSTEM)。外显子引物由中国协和医科大学基础医学研究所提供，外显子引物序列为：
EXON 6扩增130 bp
p53-6R
5′-GATTGCTCTTTAGGTCTGGCCCCTCCTCAGC-3′
p53-6L
5′-CAGACCTCAGGCTCATAGG-3′
EXON7扩增118 bp
p53-7R
5′-CTAGGTTGGCTCTGACTGTACCACCATCC-3
p53-7L
5′-TGACCTGGAGTCTTCCAGTGTG-3′
EXON 8扩增141 bp
p53-8R
5′-GTAGTGGTAATCTACTGGGAACGGAACAGC-3′
p53-8L
5′-CTCGCTTAGAGCTCCCTGGGGGG-3′
取14 μl PCR产物加去离子甲酰胺变性液16 μl，混匀后于97℃变性8 min迅速置于冰洞或碎冰降温，加样于8%聚丙烯酰胺垂直电泳胶上，采用PBR 322/Hinf I为参照物，1X TBE为缓冲液，4℃冰箱内500V电泳3 h，轻柔取下胶于避光染色缸内0.1%硝酸银染后后观察结果。电泳仪系北京六一仪器厂生产的ECP 3000多用电泳仪及配套的DYY-Ⅲ 28 B型夹心式直式电泳槽。
2 结果
15例确诊肺癌患者、5例临床怀疑肺癌患者、2例非肿瘤患者的22份痰标本(取自两医院)接受检查。患者年龄47～74岁，平均62岁。有长期吸烟史(指数＞400年支)者16例，不吸烟者6例。男性17例，女性5例。确诊的肺癌组织学类型分别为：鳞癌7例，小细胞癌4例，腺癌1例。癌疑2例，下咽癌肺转移1例(亦为鳞癌)。详见表1。
改良Saccomanno法浓缩找癌细胞：15例确诊肺癌患者10例痰细胞学检查出癌细胞(占66.7%)，5例临床怀疑肺癌患者及2例非肿瘤患者痰细胞学阴性。浓缩法细胞密集，痰细胞学形态不受影响。
表1 22例痰细胞DNA p53 PCR-SCP结果与临床病理诊断比较
| 组 别 |
例数 |
PCR-SSCP |
P值 |
| 阳性(%) |
阴性(%) |
| 男性 |
17 |
6(35) |
11(65) |
＞0.05 |
| 女性 |
5 |
2(40) |
3(60) |
| 吸烟 |
16 |
6(37.5) |
10(63.5) |
＞0.05 |
| 不吸烟 |
6 |
2(33.3) |
4(66.7) |
| 原发性肺癌 |
| 鳞癌 |
7 |
4(57) |
3(43) |
| 小细胞肺癌 |
4 |
1(25) |
3(75) |
| 腺癌 |
1 |
1(100) |
0 |
| 未定型 |
2 |
0 |
2(100) |
| 下咽癌肺转移 |
1 |
0 |
1(100) |
| 临床怀疑肺癌 |
5 |
2(40) |
3(60) |
| 结节病 |
1 |
0 |
1(100) |
| 右中肺炎 |
1 |
0 |
1(100) |
22例痰标本DNA提取顺利，平均DNA浓度为(1.88±1.49) g·L-1，OD260 nm/OD280 nm 为1.61，提示DNA提取满意。
PCR-SSCP银染检查22例，确诊肺癌患者组6例出现p53基因异常(6/15，占40%)，其中p53基因异常均在10例痰细胞学阳性组(6/10)，5例痰细胞学阴性的确诊肺癌患者组均未发现p53基因异常。5例临床怀疑肺癌患者，痰细胞学检查阴性，2例出现p53基因异常(2/5，占40%)。2例非肿瘤患者(1例为结节病，另1例为右中叶肺炎)及正常肺组织均未见p53异常。p53基因异常以外显子7(4例)及外显子8(3例)多见，外显子6仅1例出现异常。见表2。
表2 15例确诊肺癌标本痰细胞学与p53 PCR-SSCP对照表(例)
| PCR-SSCR检查 |
氮细胞学检查 |
合计 |
| 阳性 |
阴性 |
| 阳性 |
6 |
0 |
6 |
| 阴性 |
4 |
5 |
9 |
3 讨论
目前由于肺癌早期诊断缺乏有效手段，已有作者证明p53免疫反应可作为早期支气管鳞化组织癌变的标志〔6〕。如何早期获得癌前标本使患者受益成为关键。痰液留取方便，不增加患者痛苦成为研究者探索肺癌早期诊断的热点和希望〔4〕。
改良Saccomanno法浓缩收集痰标本，可方便患者留取痰液，增加痰液收集量，更重要的是能长期贮存痰液，为痰p53基因检测提供了保证。特殊粘痰松解剂既分离粘液，浓缩细胞成分又不影响细胞形态及DNA提取，是PCR-SSCP成功的关键。本组22份痰标本DNA浓度为(1.88±1.49) g·L-1，OD260 nm/OD280 nm为1.61说明此法可获得足量、高质量及可贮存的合格痰标本。
野生型p53基因位于人染色体17 b，基因组DNA分子长度为20 kb，含有11个外显子。p53基因突变多发生在外显子5～8(占87%)〔1〕，p53基因突变与吸烟〔7〕、放射线〔8〕及内源性遗传因素有关〔9〕。本组16例吸烟指数＞400年支者，6例发生p53基因突变(37.5%)。非吸烟者6例，2例发生突变(33.3%)两者统计学无差别，说明致肺癌患者p53突变是一复杂多因素过程。突变组不同性别间突变构成比亦无明显差别(男∶女为35%∶40%)。
确诊肺癌15例中，6例发现p53基因异常(40%)，且均存在于痰细胞学阳性痰标本中，与痰细胞学一致性较好，可靠性大，对肺癌具一定诊断作用。
5例临床临疑肺癌患者，经纤支镜或痰细胞学检查未能确诊，而痰p53-PCR-SSCP 2例阳性(40%)，目前患者正在随访中其价值值得探讨。国外Mao等〔10〕检查10例痰细胞学示不典型增生后证实系肺癌的患者贮痰标本，采用测序法检测p53基因及K-ras基因，其中8例出现p53或K-ras基因异常，早于临床1～13月诊断肺癌，说明部分不典型增生等癌前病变即有p53基因异常。本方法有可能发现早期肺癌患者。
2例非肿瘤患者及健康肺组织均未见p53基因异常，提示本研究充分的可靠性。
从表2得知，p53基因PCR-SSCP检查阳性率低于痰细胞学。由于痰p53基因PCR-SSCP能早期诊断肺癌，联合K-ras基因检测〔10〕或p53蛋白染色能增加基因异常检出率〔11〕，显示其诊断肺癌的优势。这也为早期诊断肺癌、降低肺癌病死率开辟了新的研究领域。
作者简介：操乐杰，男，37岁，硕士，副主任医师
参考文献
1 Szabo E, Birrer MJ. Early detection of lung cancer. Semin Oncol,1993;20(4):374～382
2 Levine AJ, Momand J, Finlay CA. The p53 tumor suppressor gene. Nature,1991;351(6326):453～456
3 Willaim PM. p53 alteration sinprogenitor lesion of the bronchus, esophages, oral cavity and colon. Cancer Detection and Prevention,1995;19(6):503～511
4 Murakami Y, Hayashi K, Sekiya T. Detection of aberrations of the p53 alleles and gene transcipt in human tumor cell lines by single-strand conformation polymorphism analysis. Cancer Res,1991;51(13):3356～3361
5 Saccomanno G, Saunders RP, Ellis H. Concentration of carcinoma or atypical cells in sputm. Acta Cytologia,1963;7(3):305～314
6 Bennett WP, Colby TV, Vahakanges KH et al. p53 protein accumulates frequently in early bronchial neoplasis. Cancer Res,1993;53(20):4817～4822
7 Dosoka-akita H, Shindoh M, Fujino M et al. Abnomal p53 expression in human lung cancer in associated with histologic subtypes and patient smoking history. Am J Clin Pathol,1994;102(5):660～664
8 Takeshima Y, Seyama T, Bennett WP et al. p53 gene mutations in lung cancers from Japanese non-smokers and atomic bomb survirors. Lancet,1993;342(8886/8887):1520～1521
9 Jones PA, Buckley JD, Henderson BE et al. From gene to carcinogen: a rapidly elolving filed in molecular epidemiology. Cancer Res,1991;51(13):3617～3620
10 Mao L, Hruban RH, Boyle HO. Detection of oncogene mutations in sputum precedes diagnosis of lung cancer. Cancer Res,1994;54(7):1634～1637
11 Tockman MS, Gupta PK, Myers JD et al. Sensitive and specific monoclonal antibody recongnition of human cancer antigen an preserved sputum cells:a new approach to early lung cancer detection. J Clin Oncology,1988;6(9):1685～1693
1999-08-01收稿，1999-10-15修回
用户登录 
新用户注册