p16、Cyclin D1和CDK4基因在胰腺癌中的表达及其意义

中国普外基础与临床杂志 1999年第6期第6卷 基础与实验研究

作者：何劲松　赖焕辉　姜立华　吕新生　曹亚　廖伟　黄幸青　王江桥　郭建平

单位：何劲松　赖焕辉　姜立华　黄幸青　王江桥　郭建平（广东省粤北人民医院普外科　韶关　512026）；吕新生（湖南医科大学湘雅医院普外科）；曹亚　廖伟（湖南医科大学肿瘤研究所）

　　关键词： 基因；胰腺癌；免疫组化

　　摘要　为探讨抑癌基因p16、癌基因Cyclin D₁和CDK4在胰腺癌中的作用及其相互关系，应用免疫组织化学方法检测了p16、Cyclin D₁和CDK4基因在胰腺癌中的表达。结果：p16在胰腺癌中为低表达，Cyclin D₁和CDK4呈过度表达； p16与Cyclin D₁呈负相关关系(P＜0.05)，Cyclin D₁与CDK4呈正相关关系(P＜0.05)。提示胰腺癌发生机理涉及p16、Cyclin D₁和CDK4基因的异常，p16低表达和Cyclin D₁高表达在胰腺癌发生中起协同作用。

THE SIGNIFICANCE OF EXPRESSION OF P16、CYCLIN D₁ AND CDK4 IN PANCREATIC CARCINOMA

He jinsong, Lai Huanhui, Jian Lihua, et al.

　　Department of General Surgery, The People′s Hospital of Yuebei, Guangdong province, Shaoguan 512026

　　Abstract　To study the mechanism of p16,Cyclin D₁ and CDK4 and their relationship with pancreatic carcinoma, their expressions were examined by immunchistochemistry methods. Results: overpression of Cyclin D₁ and CDK4 was revealed in these samples and p16 was undertectable. There was a negitive correlation between p16 and Cyclin D₁ (P＜0.05), and a positive relation between Cyclin D₁ and CDK4 (P＜0.05). The results indicate that abnormality of p16, Cyclin D₁ and CDK4 may be involved in the molecular mechanism of pancreatic carcinoma, p16 lower expression and Cyclin D₁ over expression may coexit in the development of pancreatic carcinoma.

　　Key words　　Gene　　Pancreatic carcinoma　　Immunchistochemistry

　　细胞的正常生长依赖于细胞周期中各种调节因子的平衡调控，其中包括细胞周期素D₁(Cyclin D₁)和周期素依赖性激酶(CDK4)对细胞生长的正性调控及周期素依赖性激酶抑制因子p16对细胞生长的负性调控。调控环路中任一调节因子发生紊乱都将导致细胞增殖异常，诱发肿瘤^〔1，2〕。胰腺癌的发病机理是否也存在上述癌基因和抑癌基因的功能紊乱，具体调节机理如何，尚缺乏进一步的研究。为检测p16、Cyclin D₁和CDK4在胰腺癌中的改变情况，探索与胰腺癌发生的关系，用免疫组织化学方法对34例原发胰腺癌进行了研究分析。

　　1　材料与方法

　　1.1　标本来源

　　34例胰腺癌组织取自我院和湘雅医院病理科1996年9月至1998年4月手术切除标本，其中高分化20例，中分化4例，低分化10例； 伴有淋巴结转移30例，无淋巴结转移4例。另取6例良性胰腺病变组织作为对照。标本均经4%的中性多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，5 μm厚连续切片。

　　1.2　抗体和探针

　　兔抗人p16(N-20)、Cyclin D₁(H-295)多克隆抗体和羊抗人CDK4(C-22)多克隆抗体均购自美国Stata Cruz生物技术公司，免疫组化SP试剂盒购自福洲迈新生物技术公司。

　　1.3　免疫组化染色

　　1.3.1　常规SP免疫组化染色法　Cyclin D₁经微波抗原修复(温度95℃，时间两个5分钟)； p16、Cyclin D₁和CDK4抗体的免疫产物均用过氧化物酶-DAB显色，抗体效价分别为1/40、1/50、1/50。免疫组化阴性对照采用一抗为PBS替代，阳性对照为试剂盒提供的人宫颈癌及乳腺癌阳性对照片。

　　1.3.2　染色结果判定标准　参照Fromowitz等^〔3〕方法，在高倍镜下对细胞核内反应作如下评分： ①无着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分； ②阳性范围： ＜5%为0分，5%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，＞75%为4分。两项结果相加＜2分为阴性(-)，2～3分为弱阳性(+)，4～5分为中度阳性(++)，6～7分为强阳性(+++)。

　　1.4　统计学处理

　　两两间比较采用χ²检验，P＜0.05为有显著性意义。所有数据统计均在Stata软件上进行。

　　2　结果

　　2.1　胰腺良、恶性病变组织中p16、Cyclin D₁和CDK4基因的表达

　　免疫组化结果判断均以核内染色为阳性信号，6例胰腺良性病变组织中分别可见部分腺管细胞呈现3种基因的弱阳性蛋白表达。

　　p16的表达在34例胰腺癌组织中10例呈过度表达(++～+++)，占29.4%； 8例弱阳性，占23.5%； 16例阴性，占47.1%； 阴性病例中部分组织的相对正常腺体细胞可见p16呈弱阳性表达。Cyclin D₁有18例呈过度表达，占52.9%，表达增高的细胞仅限于肿瘤细胞； 14例弱阳性表达，占41.2%； 2例为阴性表达，占5.9%。34例中14例p16阴性或弱阳性表达的肿瘤，Cyclin D₁均呈过度表达； 6例Cyclin D₁弱阳性表达的肿瘤，p16呈过度表达； 有2例p16和Cyclin D₁均呈阴性表达； 2例p16阴性的肿瘤Cyclin D₁为弱阳性； 其余10例均对应地呈强弱不等的阳性表达。CDK4有20例呈过度表达，占58.8%； 8例呈弱阳性表达，占23.5%； 6例阴性表达，占17.6%。

　　2.2　p16、Cyclin D₁和CDK4蛋白表达在胰腺癌中的相互关系及与胰腺癌分化、淋巴结转移的关系

　　应用配对卡方检验，p16与Cyclin D₁呈负相关关系(P＜0.05)； Cyclin D₁与CDK4呈正相关关系(P＜0.05)； p16与CDK4无明显关系(P＞0.05)。不同分化程度的胰腺癌组织中p16、Cyclin D₁和CDK4蛋白表达程度不同，但相关分析无显著性差异(P＞0.05)； 本研究中未发现p16、Cyclin D₁和CDK4蛋白表达与胰腺癌淋巴结转移的关系(P＞0.05)。见表1、2。

表1　p16、Cyclin D₁及CDK4蛋白表达的相关性

　　*P＜0.05

表2　p16、Cyclin D₁及CDK4表达与胰腺癌分化、淋巴转移的关系

　　*P均＞0.05

　　3　讨论

　　在原发性胰腺癌组织切片上观察细胞周期调节蛋白p16、Cyclin D₁和CDK4的表达状态，它们与胰腺癌组织分化和淋巴结转移的关系。结果表明： 47.1%的胰腺癌标本中没有检测到p16蛋白，提示胰腺癌中存在p16基因的丢失或突变。p16的失活在胰腺癌的发生中占有重要地位，与前人报道相符^〔4，5〕。研究显示： Cyclin D₁过度表达在胰腺癌标本中占52.9%，且Cyclin D₁过度表达和p16低表达同时存在于41.2%的胰腺癌中，二者之间呈负相关，表明胰腺癌中p16和Cyclin D₁异常可同时存在并呈反馈调节参与肿瘤的发生。CDK4在胰腺癌中也存在高频率过度表达(58.8%)，且与Cyclin D₁呈正相关参与肿瘤发生，与Khatib等^〔6〕报道一致； 但CDK4改变与p16异常无明显关系，提示胰腺癌中Cyclin D₁与CDK4结合的活性强于p16。本研究结果不仅为p16和Cyclin D₁/CDK4基因在调节细胞周期活动中构成反馈调节通路的推论提供了依据^〔7〕，而且也证实了这一生长抑制通路在胰腺癌中是一常见现象，表明胰腺癌的分子发生机理中涉及p16和Cyclin D₁/CDK4基因的异常； p16低表达和Cyclin D₁过度表达在胰腺癌的发生中起协同作用。

　　我们未发现p16、Cyclin D₁和CDK4异常与肿瘤分化的关系，可能与样本例数少有关，但同一类型的胰腺癌存在不同的基因改变，肿瘤内具有不同的细胞亚群，其生物学性状可能不同^〔8〕。本研究中未发现p16、Cyclin D₁和CDK4与淋巴转移的关系，可能与临床所取标本大部分为晚期胰腺癌有关。因此，提高胰腺癌的早期诊断，对胰腺癌基因的深入研究有重要意义。

　　本研究结果表明，p16、Cyclin D₁和CDK4异常在胰腺癌发生中占有重要地位，进一步了解它们在细胞周期中的反馈机理，设法调节抑癌基因p16和癌基因Cyclin D₁/CDK4之间的平衡关系，对肿瘤的基因治疗有着极其重要的价值。

　　参考文献

　　1　Hunter T, Pines J. Cyclin D₁ and caner Ⅱ: Cyclin D₁ and CDK inhibitors come of age. Cell, 1994; 79(2)∶573

　　2　Kamba. Cell-cycle regulators and cancer. Trends Genet, 1995; 11(2)∶136

　　3　Fromowitz FB, Viola MV, Chao S, et al. Ras p21 expression in the progression of breast cancer. Human Pathol, 1987; 18(12)∶1268

　　4　Caldas C, Hahn SA, Da-Costa CT, et al. Frequent somatic mutations and homozygous deletions of the p16 (MTS1) gene in pancreatic adenocarcinoma. Nat Genet, 1994; 8(1)∶27

　　5　Bartsch D, Shevlin DW, Tung WS, et al. Frequent mutation of CDKN2 in primary pancreatic adenocarcinomas. Genes Chromosomcs Cancer, 1995; 14(3)∶189

　　6　Khatib ZA， Matsushime H. Coamplification of the CDK4 gene with MDM2 and GLI in human sarcomas. Cancer Res, 1993; 53(20)∶5535

　　7　Serrano M, Hanon GJ, Beach DA. A new regulatory motif in cell-cycle control causing specific inhibition of cyclin D/CDK4. Nature, 1993; 366(3)∶704

　　8　Yeager T, Studler W, Belair C, et al. Increased p16 levels correlate with pRb alterations in human urothelial cells. Cancer Res, 1995; 55(2)∶493

(1998-12-01收稿，1999-07-02修回)