乳腺癌中p53基因DNA水平突变与核蛋白水平突变的比较

中华外科杂志 1998年第11期第36卷 临床研究

作者：范萍　武正炎　查小明　王萱仪　王水

单位：210029 南京医科大学第一附属医院普外科

关键词：聚合酶链反应；基因，p53；免疫酶技术；乳腺肿瘤；点突变

　　【摘要】　目的　研究p53基因DNA水平和蛋白水平的突变。　方法　分别采用多聚酶链反应-单链构象多态分析银染方法和链酶亲和素-生物素-过氧化物酶复合物(strep-avidin-biotin-peroxidase complex,SABC)免疫组化方法,检测了54例乳腺浸润性导管癌标本。　结果　22例在DNA水平突变阳性，突变率为41%；32例在核蛋白水平突变，突变率57%。其中22例DNA突变阳性者,核蛋白突变均阳性；而32例DNA水平突变阴性者,核蛋白突变阳性者9例，占28％。p53 DNA突变与核蛋白突变之间有显著相关性，并且两者都与患者的淋巴结转移以及雌、孕激素受体表达有关(P＜0.01)。　结论　免疫组化是一种快速检测p53是否存在异常的有效方法。但是在蛋白水平突变阳性者中存在一定的假阳性。p53突变阳性患者预后较差。

　　Comparison of nuclear accumulation of p53 protein with mutations in the p53 gene on the tissues of human breast cancer Fan Ping,Wu Zhengyan, Cha Xiaoming,et al.Department of General Surgery，First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University,Nanjing 210029.

　　【Abstract】　Objective　To compare nuclear accumulation of p53 protein with mutations in the p53 gene on the tissues of human breast cancer.　Method　Fifty-four invasive ductal carcinomas of breast were analyzed by polymerase chain reaction-single strand conformational polymorphism(PCR-SSCP) silver stain and strep-avidin-biotin-peroxidase complex (SABC) immunohistochemistry.　Result　A highly significant association between the presence of p53 gene mutation and nuclear accumulation of p53 protein was found(r=0.714,P＜0.01). All 22 tumors with p53 gene mutations showed nuclear accumulation of p53 protein. Of the 32 tumors with gene mutations undetected, 9(28%) showed nuclear accumulation of p53 protein.Both p53 mutation protein and p53 gene mutations were prevalent in steroid and progesterone receptors negative tumors(P＜0.05). There was a statistically significant association between the nuclear accumulation of p53 protein and lymphonode invasion (P＜0.05). So did p53 gene mutations (P＜0.05). Therefore, p53 abnormalities might be associated with an aggressive phenotype in breast cancer.　Conclution　The immunohistochemical detection of nuclear p53 protein accumulation is highly associated with p53 gene mutations in breast cancer tissues. This method is useful for rapid screening of p53 abnormalities. In some cases of slightly positive for p53 nuclear protein we must observe p53 genemutations to avoid the false positive reaction.

　　【Key words】　Polymerase chain reaction　　Genes,p53　　Immunnonezyme techniques　　Breast neoplasms　　Point mutation

　　人类多种肿瘤中都有p53基因的突变，p53基因突变与人类肿瘤的分化、增殖以及肿瘤细胞的凋亡有关。本研究主要探讨乳腺癌患者p53基因核酸水平和蛋白水平突变的关系，并探讨检测p53基因突变的更有效方法。

材料与方法

　　1．标本：32例乳腺癌石蜡标本，取自本院病理科；22例冰冻切片取自本院普外科手术切除的乳腺癌标本。以上54例病理诊断均为乳腺浸润性导管癌。

　　2.试剂：dNTPs,Taq酶，购自美国Promega公司；丙烯酰胺及p53单克隆抗体购自美国Sigma公司；免疫组化SABC 试剂盒购自博士德生物工程有限公司。

　　3.仪器：PE公司的2400 PCR仪，Pharmacia的恒温恒压电泳仪及电脑凝胶成像系统。

　　4.免疫组化方法:采用链酶亲和素-生物素-过氧化物酶复合物(SABC)免疫组化方法进行分析，具体操作按试剂盒说明书要求。

　　5.PCR-SSCP银染方法：(1)引物：p53基因第5、6、7、8外显子四对引物，用U表示上游引物，D表示下游引物，引物序列为：exon5 U:5′-GTG CCC TGA CTT TCA ACT CTG 3′，D:5′-GGG CAA CCA GCC CTG TCG 3′。exon6 U:5′-CGT CTA GAA TTC CTC ACT GAT TGC TC 3′，D:5′-CGG TCG ACA GTT GCA AAC CAG A 3′。exon7 U:5′-CGT CTA GAG GCC TGT GTT GTC TCC 3′，D:5′-CGG TCG ACG GTG GCA AGT GGC TCC 3′。exon8 U:5′-ATT TCC TTA CTG CCT CTT GCT TC 3′，D:5′-CTT GGT CTC CTC CAC CGC 3′。(2) 核酸提取：参见文献［3］的方法。(3)多聚酶链反应(PCR):常规加入PCR反应试剂、引物及模板,94℃预变性5分钟，进行循环扩增。循环变性条件为94℃、30秒，退火温度为55～60℃、30秒，根据不同引物退火温度有所变化，延伸温度为72℃、60秒，进行35个循环。(4)单链构象多态性分析(SSCP):PCR扩增产物10 μl，加变性剂30 μl，95℃变性5分钟，冰浴上骤冷，上样。8％聚丙烯酰胺凝胶电泳，恒温4℃，恒定功率30 W、4～6小时。(5)银染：取下凝胶，置10％冰乙酸中固定30分钟，双蒸水洗涤3次，0.1％硝酸银染色30分钟，双蒸水洗涤不超过20秒，3％碳酸钠显色至银染条带清晰，立即加入反应终止液。

结果

　　1．乳腺癌组织中p53突变情况：(1)SSCP-PCR银染检测p53 DNA突变的结果:正常成人外周血中抽提的DNA作为阴性对照，变性后，互补的两条单链形成两条区带;而乳腺癌突变阳性者与对照相比有不同迁移率的异常条带，DNA突变率为41%，4个外显子无突变热点。(2)p53突变蛋白在乳腺癌标本中表达情况：p53蛋白阳性染色主要位于细胞核，呈棕褐色。54例中，p53蛋白染色阳性者31例，占57％。其中冰冻切片p53阳性率为64％，石蜡切片阳性率为50％ ，说明冰冻切片的阳性率高于石蜡切片，但冰冻切片的细胞结构不如石蜡切片的清晰。

　　2．p53突变与乳腺癌关系：p53突变阳性率与患者的年龄、临床分期等无相关性，但与淋巴结的转移成正比，与雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)表达成反比,提示p53突变阳性者预后较差(表1)。

表1　p53 DNA、蛋白突变与乳腺癌的关系

　　3.乳腺癌组织中p53 DNA突变与p53蛋白突变的关系(表2)：表明两种检测方法高度相关，相关系数r=0.714,卡方检验P＜0.01，即用免疫组化法检测蛋白水平突变阳性者其DNA水平突变检出率也高。

表2　p53 DNA与p53蛋白突变的关系(例)

　　 讨论

　　p53基因是人类重要的抑癌基因,具有抑制肿瘤细胞增殖、分化等作用,还与肿瘤细胞的凋亡有关^［1，2］。从我们的研究结果中可以发现，p53突变阳性者多为Ⅱ、Ⅲ期病例且ER及PR表达多为阴性;p53突变阳性率与淋巴结转移成正相关，且淋巴结转移阳性者p53蛋白阳性细胞多为“＋＋＋”，提示p53突变多发生在乳腺癌的进展期，可作为判断乳腺癌预后的一个重要指标^［3］。

　　目前研究p53突变主要从核酸与蛋白两个水平，核酸水平突变主要为点突变^［4］。本研究采用PCR-SSCP银染的方法研究了p53的第5～8对外显子在乳腺癌中的突变情况，4个外显子在乳腺癌中都有突变，无明显的突变热点，其突变率为41%。p53突变后所编码的突变蛋白分为两类，即丢失功能型和获得功能型，两种类型都失去了抑制肿瘤的生物学活性，但丢失功能突变型蛋白同时还具有显著的类似癌蛋白样的致癌特性^［5］。p53蛋白的免疫组化方法是根据野生型p53蛋白半衰期较短，突变型p53蛋白的半衰期明显延长而建立起来的检测方法。由于野生型突变蛋白半衰期短，在组织中很难检测到，所以免疫组化检测到的大多为突变型p53蛋白。在乳腺癌组织中p53突变蛋白表达率为57％，该突变率高于核酸水平的检出率。其中新鲜组织冰冻切片表达率为64％，石蜡切片表达率为50％，但新鲜组织的细胞结构不如石蜡切片的清楚。p53 DNA水平突变阳性者其蛋白水平突变亦阳性，且多为“＋＋＋”，核酸水平突变阴性而蛋白水平突变阳性者，多为“＋”，说明免疫组化强阳性结果是有临床参考价值的，弱阳性者中存在一定数量的假阳性，最好同时做DNA水平的突变。

　　免疫组化的检测结果主要由所用的单克隆抗体决定。如果该单克隆抗体是针对突变型p53蛋白某一抗原决定簇而产生的，则与核酸水平的突变符合率高；如果制备该单克隆抗体的抗原决定簇是野生型和突变型p53蛋白所共有的，则存在着野生型和突变型蛋白之间的交叉反应，假阳性率也就相应地升高，而且标本存放的时间越短，野生型蛋白衰变得越不完全，这种交叉反应越明显。本研究也显示出新鲜标本免疫组化检出率明显高于石蜡标本。如果所用的单克隆抗体为突变型p53蛋白特异的单抗，新鲜标本与石蜡标本检出率之间仍会存在一定程度的差异，这主要与标本的处理方法有关^［6］。石蜡标本经过福尔马林固定，蛋白的抗原决定簇的数量、结构都将受到影响，抗原决定簇的反应性明显减弱，因而其检出率将有所降低。而新鲜标本无此处理过程，手术切除后直接在液氮中速冻，然后放入深低温冰箱中长期保存，对抗原决定簇的影响较小，因而其检出率在一定程度上会比石蜡标本高。

　　PCR-SSCP方法是快速检测点突变的方法，互补的两条单链由于碱基组成及序列不同，可形成不同的构象，因而在中性低温的环境下，电泳迁移率不同，形成两条区带。基因结构如发生突变、缺失或插入，会改变基因的碱基组成、排列顺序或长度，导致空间构象变化，因而与野生型的相比而呈现不同迁移率的区带，可以不通过测序来比较不同肿瘤突变的情况^［7］。

　　总之，本研究发现p53基因突变与否是判断乳腺癌预后的重要指标，p53 DNA水平突变的检测结果比免疫组化检测结果更有参考价值，后者受所用的单克隆抗体、标本处理方法等多种因素影响。但是免疫组化是一种简单易行的检测方法，与DNA检测结果间有显著相关性，组化强阳性结果与DNA水平突变符合率很高，有临床参考价值；组化结果弱阳性者应同时做DNA水平的检测，以进一步明确是否存在p53基因的突变。

参考文献

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　　2　Yin Y, Tainsky MA, Bischoff FZ,et al. Wild-type p53 restores cell cycle control and inhibits gene amplification in cells with mutate p53 alleles.Cell,1992,70:937-948.

　　3　Mazars R, Spinardi L, Bencheikh M,et al.p53 mutation occur in aggressive breast cancer.Cancer Research, 1992,52:3918-3923.

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　　5　Levine AJ,Momand J,Finlay CA. The p53 tumor suppressor gene. Nature,1991,351:453.

　　6　Perault LF, Adelaide J, Houvenaeghel G, et al. Optimization of immunohistochemical detection of ERBB2 in human breast cancer: impact of fixation. J Pathol, 1994,173:65-75.

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（收稿：1997-08-22　修回：1998-03-22）