鼻咽癌中D型周期素的差异性表达及cyclinD1基因扩增的研究

中华耳鼻咽喉科杂志 2000年第4期第35卷 基础研究简报

作者：肖绘　夏林庆　顾焕华　邓锡云　周见远　Michael F. Press　曹亚

单位：肖绘　夏林庆　顾焕华　邓锡云　曹亚（410078 长沙 湖南医科大学肿瘤研究所）；周见远　Michael F. Press（美国南加州大学病理系）

　　一、材料与方法

　　1.由湖南省肿瘤医院病理科提供20例石蜡切片标本。其中18例鼻咽低分化鳞癌，1例鼻咽中分化乳头状鳞癌，1例鼻咽慢性炎症。

　　2.质粒抽提、鉴定、重组插入片段的回收、探针的标记：CyclinD1质粒由美国南加州大学病理系周见远博士提供,碱裂解法大规模抽提质粒,以纸浆法回收的重组插入片段为模板，根据Dig DNA Labeling and Detection Kit提供的说明书进行Dig-11-dUTP标记及探针效率检测。

　　3.SP法：根据链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶免疫组化染色试剂盒提供的说明书进行免疫组化检测，DAB显色。CyclinD1(H-295)、CyclinD2(C-17)、CyclinD3(C-16)均为亲和纯化的兔多克隆抗体，分别按1∶50、1∶100、1∶100稀释。常规设阳性、空白对照，鼻咽慢性炎症上皮为正常对照。首先将染色强度分为4级。0级：无染色；1级：染色弱，呈淡黄色；2级：中等染色，呈黄褐色；3级：染色强，呈棕褐色。在此基础上进一步将蛋白表达状况分为4类：无染色强度≥2级的细胞为阴性(-)，10%以下的细胞染色强度≥2级为弱阳性(+)，10%-50%的细胞染色强度≥2级为中等阳性(++)，50%以上的细胞染色强度≥2级为强阳性(+++)。

　　4. RNA原位杂交。判断标准：胞浆内有紫蓝色斑点即为阳性染色，阳性染色细胞占细胞总数的10%、10%-50%、50%以上分别为弱阳性(+)、中等阳性(++)、强阳性(+++)。所设对照同上。

　　5. 石蜡切片荧光原位杂交。判断扩增的标准：cyclinD1与11号染色体数目之比大于2或在不考虑11号染色体数目的情况下cyclinD1基因数目大于4为扩增。以MDA MB-453细胞系为阳性对照。

　　二、结果

　　D型周期素蛋白在鼻咽癌中差异性表达。cyclinD1、D2 、D3 蛋白均定位于细胞核，呈颗粒状或斑块状，细胞间染色强度不一。19例鼻咽癌中，4例cyclin D1强阳性（图1），11例中等阳性，4例弱阳性，其中3例的癌旁上皮cyclinD1 蛋白阴性。从以上19例鼻咽癌中随机选择包括cyclinD1蛋白强、中等、弱阳性的病例共9例、8例分别检测了cyclin D2、D3蛋白的表达。8/9例鼻咽低分化鳞癌cyclinD2阴性， 1例弱阳性（图2）。8/8例鼻咽低分化鳞癌cyclinD3弱阳性，大量浸润淋巴细胞染色阳性（图3）。1例鼻咽炎症上皮cyclinD1、D2 、D3 蛋白均为阴性。

　　同样从以上19例鼻咽癌中选择10例进一步检测了cyclinD1 mRNA的表达。cyclinD1 mRNA集中于胞浆的一端，呈深浅、大小不一的紫蓝色斑点。6/10例鼻咽癌中等阳性（图4），4例弱阳性，1例鼻咽炎症上皮cyclinD1mRNA阴性。

　　同样从以上19例鼻咽癌中选择7例进一步检测了cyclinD1基因的扩增。3/7例鼻咽癌cyclinD1基因扩增，在FITC滤色片下呈数十个绿色信号点，聚集成簇（图5）。

　　三、讨论

　　本研究首次证实了cyclinD1蛋白在鼻咽癌中过表达，为进一步探讨它在鼻咽癌发病中的意义奠定了基础。

　　除了基因扩增，还有别的机制导致D1表达异常增高，最新研究表明核转录因子NF-κB能诱导cyclinD1的表达^［1］，这为进一步探讨信号传导分子异常与cyclinD1的改变在鼻咽癌中的意义提供了极有意义的启示。

　　cyclinD3谱系依赖性地瞬时或长期高表达分别与启动或维持不同发育阶段的成熟表型有关^［2］。鼻咽癌大多为低分化鳞癌，cyclinD3在鼻咽癌中高频性弱表达可能与这种低分化特性有关。

　　本研究建立了鼻咽癌中D型周期素蛋白的表达谱，D型周期素的3个成员在鼻咽癌中的差异性表达提示它们在鼻咽癌细胞的G1/S转换及鼻咽癌的发生中可能发挥着不同的作用。cyclinD1在鼻咽癌中的异常增高及基因扩增可能提示它与鼻咽癌的发病密切相关。

图1　鼻咽癌中cyclinD1蛋白强阳性表达。阳性染色（箭头所示）位于核内，呈深浅不一的棕褐色颗粒或斑块。SP法×400

图2　鼻咽癌中cyclinD2蛋白弱阳性表达。阳性染色（箭头所示）位于核内，呈深浅不一的黄褐色颗粒或斑块。SP法 ×400

图3　 鼻咽癌中cyclinD3蛋白弱阳性表达。阳性染色（箭头所示）位于核内，呈斑块或环状，大量浸润淋巴细胞染色阳性。SP法 ×400

图4　 鼻咽癌中cyclinD1mRNA中等阳性表达。阳性染色（箭头所示）集中于胞浆的一端，呈深浅、大小不一的紫蓝色斑点。RNA原位杂交 ×400

图5　鼻咽癌中cyclinD1基因的扩增。核内数十个绿色信号点（箭头所示），聚集成簇。荧光原位杂交 ×1 000

　　基金项目：国家科技部恶性肿瘤发生与发展基础性研究基金资助项目(G1998051201)

　　通信作者：肖绘（Email: wxyxh@public.cs.hn.cn）

参考文献

　　1，Michael H, Daniel K, Michael S, et al. NF-κB function in growth control: regulation of cyclinD1 expression and G0/G1-to-S phase transition. Mol Cell Biol, 1999, 19:2690-2698.

　　2，Jirina B, Jiri L, Jiri B, et al. CyclinD3: Requirement for G1/S transition and high abundance in quiescent tissues suggest a dual role in proliferation and differentiation. Oncogene, 1998, 17:1027-1037.

(收稿日期：1999-12-13)