快中子诱导人鼻咽癌细胞系凋亡的研究
中华放射医学与防护杂志 1999年第5期第19卷 基础研究
作者：梁克 何少琴 冯炎 唐锦华 冯勤富 沈瑜 殷蔚伯 徐国镇 刘新帆 王绿化 高黎
单位：梁克、冯勤富、沈瑜、殷蔚伯、徐国镇、刘新帆、王绿化、高黎 100021 北京，中国医学科学院肿瘤医院放疗科；何少琴 冯炎 上海医科大学肿瘤医院肿瘤放疗科；唐锦华 中国科学院高能物理研究所十一室
关键词：中子射线；凋亡；鼻咽癌
【摘要】 目的 研究中子不同剂量照射人鼻咽癌(CNE-2)细胞凋亡发生特点及与X射线所致凋亡的差异。探讨凋亡在中子治疗肿瘤中的作用及临床意义。方法 采用琼脂糖凝胶电泳及DNA特异性荧光染色方法(Hoechst33342)检测照射后不同时间人鼻咽癌(CNE-2)细胞。结果 发现中子可诱导人鼻咽癌细胞发生凋亡，这种凋亡发生存在着一定的时间剂量相关性。在相同剂量照射下，同一时间点上，中子照射所致的凋亡反应强于X射线所致的凋亡。结论 快中子照射离体细胞可引起较强的凋亡反应。中子杀伤肿瘤的机理可能也是主要通过凋亡途径来实现的。
Apoptosis of nasopharyngeal carcinoma cell line(CNE-2) induced by neutron irradiation
LIANG Ke,HE Shaoqing,FENG Yan,et al.
Cancer Hospital,Chinese Academy of Medical Sciences,Beijing 100021,China
【Abstract】 Objective To study the apoptotic response of the nasopharyngeal carcinoma cell line (CNE-2) induced by neutron irradiation.Methods CNE-2 cells were cultured as usual.Using the techniques of DNA agarose gel electrophoresis and DNA special fluorescent staining , the status of apoptosis in CNE-2 cells after neutron irradiation was detected.Results It was shown that the apoptosis can be induced in CNE-2 cell after neutron radiation.Six hrs,after different doses of neutron(0/0.667/1.333/2.000/2.667/3.333Gy) and X-ray (0/2/4/6/8/10 Gy) irradiation the apoptotic rates were 2.4%,6.3%,7.1%,9.5%,13.5%,14.6% and 2.4%,3.8%,5.7%,7.8%,10.4%,11.7%, respectively;at 48hrs they were 18.3%,21.5%,22.8%,29.3%,34.2% and 13.7%,17.6%,21.3%,25.6%,28.9%, respectively.At 10hrs after neutron irradiation the DNA ladder of apoptosis could be detected between 0.667-3.333 Gy doses in CNE-2 cells by DNA agarose gel electrophoresis.Conclusion Neutron radiation can induceapoptosis in tumor cells.Compared with the x-ray,neutron induces apoptosis in larger extent than X-ray in the same condition;meanwhile,apoptosis after irradiation is dose and time dependent.
【Key words】 Neutron beams Apoptosis Nasopharyngeal carcinoma
快中子为高LET射线，对细胞周期依赖性小，具有较高的相对生物效应(RBE=3)、照射后细胞亚致死及潜在致死损伤难以修复等特性，因此快中子优于X射线，尤其对大多数X射线抗拒的肿瘤类型有较好的疗效。我国第一台快中子治癌装置(质子加速器)是由中国科学院高能物理研究所所研制，约在1992年尝试进行临床肿瘤的放射治疗。
近年来对X射线所诱导的细胞凋亡及特点研究较多，表明高能X射线可导致肿瘤细胞发生凋亡，凋亡的出现与放射剂量、时间及细胞固有的放射敏感性都呈一定的相关性。相对于X射线，国内外有关中子所致细胞死亡的方式及其特点报道极少。
本工作从中子和X射线照射人CNE-2所致凋亡反应来研究中子杀伤肿瘤的死亡机理，发现中子可以诱导人CNE-2发生凋亡，凋亡发生的比例及时间，上升趋势与X射线相近似。但比较而言，相同剂量照射下，同一时间点上，中子照射所致的凋亡大于X射线所致的凋亡。研究工作初步得出中子可以引起肿瘤细胞较强的凋亡反应，中子杀伤肿瘤的机理可能也是主要通过凋亡途径来实现的。
材料和方法
1.肿瘤细胞株
人鼻咽癌细胞系，由本室保存并传代(来自基础所高进教授实验室)
2.中子及X射线发生器
X射线加速器为本院放疗科6 MV-X射线机，吸收剂量分别为0、2、4、6、8、10 Gy.
中子发生器为中科院高能物理研究所.中子照射参照X射线照射剂量的1/3(相对生物效应RBE=3)。吸收剂量为0、0.667、1.333、2.000、2.667、3.333 Gy.
3.实验步骤：①细胞培养：CNE-2采用DMEM培养基，37℃CO2温箱培养。血清浓度为15%灭活新生牛血清，青、链霉素终浓度各为100 U/ml，5.6% NaHCO3调至适宜pH值，再补充终浓度为100 mg/L的谷氨酰胺，待细胞长至单层后，用PBS缓冲液冲洗二次，加入1 ml 胰酶工作液，消化后弃胰酶液，加入新鲜营养液，吹打，待细胞分成单个后，以(30～50)万/ml细胞浓度接种到新的培养瓶中继续培养，照射前24小时换新鲜培养液。②照射：中子：传代后24小时的细胞，保温态下照射，吸收剂量分别为0、0.667 、1.333、2、2.667和3.333 Gy(中子照射需参照中科院高能物理研究所唐锦华等的设计)。每次预置吸收剂量(DT)为66.7 cGy，累积照射时间7.139 min。培养瓶条件：营养液厚度为1.8 cm，瓶壁厚度为0.1 cm，瓶有效高度为5.5 cm。
X射线：取传代后24小时的细胞进行照射，照射条件为能量6 MeV加速器X射线机，剂量率约为250 cGy/min。源皮距100 cm， 上加蜡板(厚度2 cm)。吸收剂量分别为0、2、4、6、8 Gy和10 Gy。
4.检测凋亡方法：考虑到中子照射条件的局限及繁琐，我们设不同剂量6个点(对应于X射线)，不同时间2个点(照后6及48小时)来计数凋亡细胞。采用荧光法观察细胞的凋亡指数(每500个所收集到的细胞中发生凋亡的细胞个数)。快捷方便，且所需细胞数不多，再结合琼脂糖凝胶电泳法来核实及定性凋亡的发生。①细胞荧光染色：将1 mg/ml Hoechst 33342加入到中子照后不同时间的CNE-2细胞中，终浓度为5 μg/ml。37℃作用10分钟用PBS洗一次1 000 r/min离心10分钟。弃上清，将细胞沉淀悬液滴在载玻片上，加上盖玻片，荧镜下观察(图1)。②琼脂糖凝胶电泳：将照射后CNE-2细胞置37℃温箱培养12小时后，按实验要求取细胞做DNA琼脂糖凝胶电泳，见文献［5］。电泳后，紫外分析仪下观察及照相(图2)。
图1 中子照射CNE-2细胞后48小时荧光染色
可见较多的凋亡细胞(箭头所指) 10×20
图2 中子照射后12小时CNE-2细胞DNA琼脂糖凝胶电泳
1.DNA分子量Marker(585bp,855bp);2. 对照；3. 0.67Gy;
4. 1.33Gy；5. 2.0Gy;6. 2.67Gy；7. 3.33Gy结果
结果见图3。CNE-2细胞经与X射线(吸收剂量：0、2、4、6、8、10 Gy)等同剂量的中子射线(吸收剂量：0、0.667、1.333、2.000、2.667、3.333 Gy)照射后，凋亡发生比率多于X射线。中子及X射线照射后6小时凋亡指数(%)分别为2.4，6.3，7.1，9.5，13.5，14.6及2.4，3.8，5.7，7.8，10.4，11.7；照射后48小时凋亡指数(%)分别为18.3，21.5，22.8，29.3，34.2及13.7，17.6，21.3，25.6，28.9。
图3 中子(n)与X射线(X)照射后不同时间(6/48小时)
CNE-2细胞凋亡(AI)百分比
Hoechst33342荧光染色，在凋亡细胞核内可见浓染致密的荧光颗粒，胞膜及核膜完整，细胞核浓聚缩小，呈单个或多个圆球形或月芽形聚集于核膜，细胞体积明显缩小，正常细胞的细胞核呈弥散均匀荧光，坏死细胞虽也可见浓染致密的颗粒状荧光，但细胞器肿胀破裂，细胞崩解成碎片，无明显的细胞结构(见图1)。DNA琼脂糖凝胶电泳也显示能辨认的凋亡发生所特有的DNA梯形条带(见图2)。
讨论
快中子系高线性能量传递(简称高LET)射线，是不带电粒子，在组织，水中或其他介质中以指数方式衰减。高能X射线是在组织中沿着次级粒子径迹上的低线性能量传递(低LET)。我们研究工作所需的中子发生器是中科院高能所研制的我国第一台快中子质子加速器，它可产生35.5 MeV质子(p)打厚铍(Be)靶，产生的快中子束流剂量率大于20 cGy/min,在0°方向上的快中子能谱从10 MeV到30 MeV有一坪区，坪区中点在20 MeV左右。快中子束中的γ光子污染不超过2%。快中子治疗的SSD一般为143 cm，SSD最大可达160 cm。照射野准直器从4 cm×4cm到15 cm，，供实验研究选用。
近年来，有关X射线所诱导的凋亡研究报道较多，表明X射线可导致肿瘤细胞发生凋亡，凋亡的出现与放射剂量，时间及细胞固有的放射敏感性都呈一定的相关性。中子相对于X射线所致的肿瘤细胞凋亡的相关工作报道较少。国内尚未见相关文献发表，国际上中子所致肿瘤细胞凋亡的研究工作也未见报道。日本的Harumi Ohyama等人报道中子和X射线照射人正常免疫淋巴细胞(胸腺及淋巴)，可观测到中子可导致细胞的凋亡，他采用30 MeV NIRS快中子照射胸腺细胞(SCA1)，形态学观察发现照后凋亡显著增加，但中子与X射线在诱导细胞凋亡的发生上差异不显著。两者剂量低时(1～2 Gy)差异显著(X射线1 Gy,AI为60%，中子AI为70%～75%；照后9小时)，其他剂量点上无明显差异。
我们研究工作发现在离体情况下，中子可诱导肿瘤细胞较强的凋亡反应，并存在着一定的时间剂量相关性。这对于今后临床肿瘤的中子治疗及其放射生物学研究，尤其是在一些对X射线抗拒性肿瘤及中子与X射线联合应用以改善疗效等方面有重要的参考价值。
同时我们认为虽然中子照射有设备复杂、成本高等不利因素，但随着科技发展及其临床放疗对一些特殊类型的肿瘤治愈率提高的要求，开展中子照射对肿瘤及正常组织凋亡及其相关基因表达等分子放射生物学研究工作十分有意义。
本课题受国家教委博士点课题(项目号：96026523)，国家自然科学基金课题(项目号：39500043)和国家科委“九五”攀登计划(B)资助
参考文献
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(收稿:1999-03-21 修回1999-06-13)
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