45例人前列腺癌雄激素受体基因B～H外显子的突变研究
中国病理生理杂志 2000年第1期第16卷 论著
作者：王晓慧 卢建 于晓玲 陈光椿 张金山 孙颍浩
单位：（第二军医大学病理生理教研室，上海 200433）
关键词：前列腺肿瘤；受体，雄激素；基因；突变
［摘 要］ 目的和方法：为探讨雄激素受体(AR)与前列腺癌(PC)发生发展及内分泌治疗不敏感的关系，我们首先建立了用PC的穿刺和石蜡切片组织检测AR基因突变的PCR－SSCP(双链构象多态性)－双链DNA循环测序法。并用上述方法检测了45例国人前列腺癌组织(6例穿刺组织，39例石蜡切片)AR基因B～H外显子的基因突变。结果：在6例患者的癌组织中证实有7个SSCP泳动变位片段（其中一患者有两个外显子异常)，这6例患者中4例为低分化腺癌，其中2例已有远处转移，而序列分析证实这2例转移患者SSCP异常的外显子H片段各存在一错义突变(Glu 872 Gln、Met 886 Ile)。这两种AR的基因突变国内外均未见报道，为在PC中新发现的突变。结论：实验发现AR突变均发生在前列腺癌的中晚期，提示AR基因突变可能与PC的进展和转移有关。
［中图分类号］ Q754 ［文献标识码］ A
［文章编号］ 1000-4718(2000)01-0008-04
Study on mutations of exon B～H of the androgen receptor gene in 45 cases of patients with prostate cancer
WANG Xiao-hui, LU Jian, YU Xiao-ling， CHEN Guang-chun
( Department of Pathophysiology, the Second Military Medical University, Shanghai 200433)
ZHANG Jin-shan， SUN Ying-hao
( Department of Urology, the Second Military Medical University, Shanghai 200433，China)
［Abstract］ AIM and METHODS: To learn more about the mechanism of prostate cancer (PC) development and progression to androgen independence, the exons B～H of the androgen receptor (AR) gene of forty-five patients with prostate cancer, six puncture tissues and thirty-nine slide tissues, were analyzed by polymerase chain reaction-single strand conformation technique (PCR-SSCP). RESULTS: Seven abnormal mobility shifts were found in five patients by PCR-SSCP. Combining the method with direct DNA cycle sequencing, two distinct missense (Glu872Gln, Met886Ile) point mutations were identified in puncture tissues from two patients of advanced prostate cancer with distant metastasis. These two point mutations represented two novel mutations. CONCLUSION: AR gene mutations might play an important role in the development and progression of prostate cancer.
［MeSH］ Prostatic neoplasms; Receptors, androgen; Genes; Mutation
前列腺癌(prostate cancer, PC)是欧美老年男性高发的肿瘤。在我国随着人口的老龄化和饮食结构的改变，发生率也逐年升高。绝大多数PC是雄激素依赖的肿瘤，内分泌治疗(手术去势和用雄激素的拮抗剂)，可抑制肿瘤生长并诱导癌细胞凋亡，是中晚期PC患者的主要治疗方法之一。国外研究表明PC组织中有雄激素受体(androgen receptor, AR)基因突变，突变可导致受体的失活、组成型激活或特异性改变，与PC的发生、发展和内分泌治疗失败有关［1,2］。因此对PC组织中AR的研究不仅有助于阐明PC的发生发展机制，还可指导临床治疗，减少盲目用药造成的浪费及副作用。由于在我国PC多采用非手术治疗，因而大体标本不易获得，所得标本是穿刺和石蜡切片组织。用其检测AR基因突变存在一些困难，故我们首先建立了检测穿刺和石蜡切片PC组织中AR基因突变的PCR-SSCP(双链构象多态性)－双链DNA循环测序法，并用该法研究了45例国人PC中AR的B～H外显子的基因突变。
材 料 和 方 法
一、研究对象：
45例前列腺腺癌(PC1～PC45)：6例穿刺组织和39例石蜡切片。6例穿刺组织PC中4例远处转移，2例局限型；39例PC石蜡切片中低分化腺癌13例，中分化腺癌12例，高分化腺癌14例，以上诊断均经病理证实。
二、方法：
1.AR基因外显子B～H的PCR扩增：挑取1～2张石蜡切片上的肿瘤细胞，加入100 μL裂解液(50 mmol/L Tris-HCl pH 8.0，1 mmol/L EDTA pH 8.0，0.5% Tween 20)55℃过夜，再加入终浓度为400 μg/μL蛋白酶K(proteinase K)55℃消化3～5 d；而穿刺组织匀浆后加入含终浓度为400 μg/μL proteinase K的裂解液100 μL，55℃消化1 d。将它们置沸水中煮8～10 min灭活蛋白酶K，离心取上清1～5 μL直接PCR扩增。所用外显子B～H的PCR引物参照文献3，每对引物均位于每个外显子两侧的内含子序列中。所扩增片断的长度依次是369 bp、413 bp、353 bp、285 bp、294 bp、416 bp、356 bp。PCR扩增的循环参数为：93℃，58℃ (外显子D为55℃，E、H 为60℃)，72℃各1 min，36个循环，最后一个循环完毕后于72℃继续延伸7 min。
2.SSCP分析：取一定量产物(约5～15 μL)于加样缓冲液(60％二甲基亚砜，0.05%溴酚蓝，0.05%二甲苯青)以2∶1比例混合，95℃变性5 min后置冰浴中冷却，上样于6%聚丙烯酰胺凝胶，以1×TBE为缓冲液，在20℃(胶中含5%甘油) 进行电泳。25 mA电泳至指示剂溴酚蓝达到胶底部。不同外显子电泳条件略有改变。凝胶银染后观察结果。
3.从凝胶中回收泳动变位片断及PCR再次扩增：从聚丙烯酰胺凝胶中回收泳动变位片段，酚/氯仿抽提后PCR扩增相应的外显子片段。
4.AR基因外显子H片断的双链DNA循环测序：用低溶点琼脂糖凝胶纯化和回收目的片断。按测序试剂盒说明书进行外显子H的测序反应，用6%的变性聚丙烯酰胺凝胶(含7 mol/L尿素)在120 W的功率条件下电泳约4 h。电泳结束后行放射自显影。
结 果
一、PCR扩增：
我们对45例PC患者的B～H外显子进行了PCR扩增。结果显示：所有患者AR基因外显子B～H均扩增出单一的特异性条带，说明这些患者AR基因在所检测的片段上没有明显的插入或缺失突变。
二、SSCP分析：
将所有患者及正常人AR基因外显子B～H的PCR扩增片段分别进行SSCP分析。与正常前列腺组织相比，只要单链DNA出现泳动变位则视为有突变。结果显示：在45例患者中有6例患者AR基因的7个外显子片段出现泳动变位，它们分别发生在外显子C、D、E、G和H (表1)。其中一患者有两个外显子异常。图1显示部分患者外显子H的SSCP分析结果。
表1 6例SSCP异常片段及前列腺癌标本情况
Tab 1 Six abnormal fractions of SSCP and general information of PC specimens
| Subject |
Specimen
source |
Exons of abnormal
mobility shifts |
Carcinoma type |
Differentiation
degree |
Metastasis
(with or without) |
| PC3 |
Puncture tissue |
H |
Adenocarcinoma |
Poor |
With |
| PC4 |
Puncture tissue |
H、C |
Adenocarcinoma |
Poor |
With |
| PC17 |
Slide tissue |
E |
Adenocarcinoma |
Moderate |
Not clear |
| PC20 |
Slide tissue |
G |
Adenocarcinoma |
Poor |
Not clear |
| PC36 |
Slide tissue |
G |
Adenocarcinoma |
Poor |
Not clear |
| PC42 |
Slide tissue |
D |
Adenocarcinoma |
Well |
Not clear |
Fig 1 SSCP analysis of exon H of AR gene in some PC patients N: Normal; PC: prostate cancer; Asterisks indicated band-shifts in PC3 and PC4
1 部分PC患者AR基因外显子H SSCP分析结果
三、SSCP异常片段的序列分析：
按照测序试剂盒对PC3和PC4患者AR基因的外显子H分别进行双链DNA循环测序，结果证实各有一错义突变(Met 886 Ile、Glu 872 Gln)，即第886位和第872位氨基酸的位置上除了正常碱基之外，还分别存在一突变碱基。这两种AR基因突变国内外均未见报道，为在PC中新发现的突变(表2和图2，3)。其余外显子的泳动变位片段仍在测序。
表2 两PC患者AR基因突变的结果
Tab 2 Mutations in the AR gene in two patients PC3 and PC4
| Subject |
Exon |
Nucleotide
substitution |
Nucleotide
sequence |
Amino acid
change |
| PC3 |
H |
G 3020 A |
ATG→ATA |
Met 886 Ile |
| PC4 |
H |
G 2976 C |
GAG→CAG |
Glu 872 Gln |
讨 论
AR基因由8个外显子组成，它们分别编码AR的三个结构区，即N-端的转录激活区，居中的DNA结合区及C-端的激素结合区。目前国外报道的AR基因突变以N-端的缺失突变和激素结合区的点突变为主。国内虽然也有实验室在从事PC组织AR基因突变的研究，但仅见AR基因单个外显子H的PCR-SSCP分析的报道［4］。
Fig 2 Sequence of exon H of AR gene in patient PC3 and normal control
The patient PC3 shows G/A in nucleotide 3020 while normal control contains only a single G at that position. The point mutation results in a corresponding replacement of Met 886 Ile
2 正常人和PC3患者AR基因外显子H序列分析结果
Fig3 Sequence of exon H of AR gene in patient PC4 and normal control
The patient PC4 shows G/C in nucleotide 2976 while normal control contains only a single G at that position. The point mutation results in a corresponding replacement of Glu 872 Gln
3 正常人和PC4患者AR基因外显子H序列分析结果
本实验室首先建立了用PC的穿刺和石蜡切片组织检测AR基因突变的PCR－SSCP(双链构象多态性)－双链DNA循环测序法。针对穿刺和石蜡切片组织标本量少，常混有正常细胞，肿瘤细胞具有异质性，制作石蜡切片时所用的一些试剂如福尔马林可使蛋白质和DNA交联而抑制PCR扩增等问题。在检测中采用了以下措施：1.挑取肿瘤细胞以减少正常细胞的混入；2.直接PCR扩增，以减少用酚/氯仿抽提DNA造成的模板损失；3.回收SSCP泳动变位的条带，以此为模板测序，提高突变检出率。按我们建立的方法，用少量穿刺组织和1～2张石蜡切片组织就可完成AR基因B～H 7个外显子的突变筛选。但测序对模板的要求比较高，一般而言，用新鲜穿刺组织的DNA作模板测序结果较好，但用石蜡切片组织的效果就稍差，表现为杂带较多，这可能是由于石蜡切片组织陈旧、DNA降解多的缘故，在方法上仍需进一步的改进。
本实验研究了45例PC患者(39例石蜡切片和6例穿刺组织) AR基因外显子B～H的突变情况。我们先PCR扩增外显子B～H的DNA片段，没有发现大片段的缺失和插入突变，再通过对PCR产物的SSCP分析筛选有点突变的外显子片段，最后用DNA双链循环测序确定突变的位点及性质。实验中共发现了7个SSCP异常片段，测序证实了两个发生在外显子H的错义突变 (Glu 872 Gln、Met 886 Ile)，这两个突变国内外均未见报道，为在PC中新发现的突变。外显子H参与编码AR的激素结合区，国外发现的外显子H的突变可使AR不能与雄激素结合，或使配体结合的特异性降低，对我们发现的两个外显子H的突变意义如何，尚需对突变AR作进一步的功能分析加以证实。
文献报道AR突变多发生在中晚期，早期比较少见［5，6］。本实验室检测了45例PC，所发现的6例SSCP异常的患者中四例低分化腺癌，一例中分化腺癌，另一例高分化腺癌；6例患者中两例(PC3和PC4)已有远距离转移，另外四例(PC17、PC20、PC36和PC42)是用陈旧石蜡切片标本做的，患者已死亡，因临床资料不全，有无转移不详。总的印象，国人AR突变也多发生在分化程度低及晚期的PC中，提示AR基因突变可能与PC的进展和转移有关。
有关PC中AR突变的发生率各家报道不一，这与所研究肿瘤的恶性程度、分期及检测方法等多种因素有关［7，8］。但总体看来，欧美人PC的AR突变率高于亚裔的日本人，提示可能有人种的差别。本研究在45例PC中只发现有6例患者AR基因的外显子片段有SSCP异常，而目前经测序证实的突变只有两例。虽然实际突变率可能会更高一些，因为没有检测的外显子A也是AR突变的好发部位［9］，另外由于肿瘤的异质性以及方法学方面的原因也会导致突变检出率降低。但初步印象是国人AR基因突变的发生率不高，AR突变的低发生率是否与亚洲人临床PC发生率低有关是个令人感兴趣的问题，值得进一步研究。
［基金项目］ 国家自然科学基金资助(39670300)
［参 考 文 献］
［1］ Tilley WD. Mutations in the androgen receptor gene are associated with progression of human prostate cancer to androgen independence ［J］. Clin Cancer Res， 1996， 2:227～285.
［2］ Bentel JM, Tilley WD. Androgen receptor in prostate cancer ［J］. J Endocrinol， 1996，151:1～11.
［3］ Lubahu DB, Brown TR, Simental JA. Sequence of the intron/exon junctions of the coding region of the human androgen receptor gene and identification of a point mutation in a family with complete androgen insensitivity ［J］. Proc Natl Acad Sci USA， 1989，86:9534～9541.
［4］ 张 勇，桂治宁. 前列腺癌中雄激素受体基因突变的研究 ［J］.中华泌尿外科杂志，1997，18(6):326～327.
［5］ Taplin ME, Bubley GT, Shuster TD. Mutation of the androgen receptor in metastatic androgen-independent prostate cancer ［J］. New Engl J Med， 1995，332:1393～1398.
［6］ Elo JP, Kvist L, Leinonen K. Mutated human androgen receptor gene detected in a prostate cancer patient is also activated by estradiol ［J］. J Clin Endocri Metab， 1995，80(12):3494～3500.
［7］ Mcintosh H. Why do African-American men suffer more prostate cancer ? ［J］. J Nat Cancer Inst，1997，89(3):188～189.
［8］ Takahashi H, Furusato M, Allsbrood WC. Prevalence of androgen receptor gene mutations in latent prostatic carcinomas from Japanese men ［J］. Cancer Res， 1995，55:1621～1624.
［9］ Feldman D. Androgen and vitamin D receptor gene polymorphisms: the long and short of prostate cancer risk ［J］. J Nat Cancer Inst， 1997， 89(2):109～111.
收稿日期］1998-10-22 ［修回日期］1999-04-15
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