p53基因突变与老年人膀胱癌预后关系的研究¹

中国老年学杂志 1999年第5期第19卷 论著

作者：王洪亮　王春喜　赵忠文　孔祥波　李景军　施　刚

单位：王洪亮　王春喜　赵忠文　白求恩医科大学第一临床学院泌尿外科，长春　130021；孔祥波　白求恩医科大学第三临床学院泌尿外科；李景军　开鲁县医院；施　刚　长春市双阳区医院

关键词：膀胱癌；p53基因；预后；突变

　　摘　要　目的　探讨老年人膀胱癌组织p53基因突变与临床分期、病理分级及预后的关系。方法　利用PCR-SSCP及PCR-直接循环测序技术，分析70例60岁以上老年人膀胱癌组织p53基因突变。结果　70例中24例(34.3%)发生p53基因突变。侵润性膀胱癌(pT₂～pT₄)组比浅表性性膀胱癌(pTa～pT₁)组、Ⅱ～Ⅲ级组比Ⅰ级组p53基因突变率明显增高(P＝0.020和P＝0.023)。突变阳性组与突变阴性组的1年、3年、5年生存率分别为63.6%、40.1%、40.1%及91.8%、76.4%、56.4%，阳性组较阴性组明显预后不良(P＝0.023)。结论　p53基因突变可作为预测老年人膀胱癌恶性进展及鉴别浸润性与浅表性膀胱癌、预后判断有用的分子生物学指标。

p53 gene mutation and prognosis of the urinary bladder tumors of the elderly

Wang Hongliang, Kong Xiangbo, Li Jingjun et al

　　Department of Urology, First Teaching Hospital of Norman Bethune University of Medical Sciences, Changchun 130021

　　To investigate the connection for the p53 gene mutation and stage, grade and prognosis in urinary bladder tumors of the elderly, polymerase chain reaction single strand conformation polymorphism(PCR-SSCP) and PCR-direct cycle sequence was performed for analysis from exon 5 to 8 of p53 gene in 70 elderly cases of urinary bladder tumors. A significant differences were found for groups with stage pTa to pT1 and pT2 to pT4(P=0.020) tumors, grades Ⅰ and grades Ⅱ to Ⅲ (P=0.023)cancer, and survival rates of 1, 3 and 5 years were observed 63.6%, 40.1%, 40.1% and 91.8%, 76.4%,56.4%, respectively(P=0.023), in case of with and without p53 gene mutations. These results suggest mutation of p53 gene may be possibly useful as molecular markers for discriminate the muscle-invasive(pT2-4) and superficial tumors, evolvement and prognosis of urinary bladder tumors of the elderly.

　　Key words　Urinary bladder tumor　p53 gene　Mutation　Prognosis

　　p53基因是人类恶性肿瘤研究最为广泛的癌抑制基因之一，乳腺癌、结肠癌、肺癌^〔1～3〕等恶性肿瘤p53基因的异常改变提示预后不良，目前尚未见到老年人膀胱癌预后与p53基因异常的确切关系的报告。我们利用PCR-SSCP(PCR-single strand conformation polymorphism)及PCR-直接循环测序技术，分析了70例60岁以上老年人膀胱移行上皮癌组织p53基因突变与临床病理改变及预后的关系，现报告如下。

　　1　材料和方法

　　1.1　肿瘤标本　收集60岁以上老年原发性膀胱肿瘤手术切除标本70例。肿瘤组织液氮处理后-70℃保存备用。

　　1.2　DNA提取　常规酚、氯仿提取肿瘤组织和同一病人外周血淋巴细胞DNA，稀释为100 ng/μl，4℃保存备用。

　　1.3　PCR-SSCP分析　选择p53基因高突变区域的外显子5～8进行分析。实验时首先用〔γ-³²P〕ATP(259 MBq/L，ICN产品)标记引物5′末端，然后进行PCR反应。PCR产物用10.0～50.0 μl DNA变性示踪剂稀释，95℃ 5 min热变性后，取1.5～5.0 μl加样于4%～6%聚丙烯酰胺凝胶，40 w，室温，2～4 h垂直电泳，真空干胶，加增感屏与X线片室温条件下曝光5 min～48 h放射自显影。

　　1.4　PCR-直接循环测序　PCR-SSCP方法筛选出的异常病例，利用PCR-直接循环测序法进行碱基序列测定。测序时以同一病人外周血淋巴细胞DNA为对照。

　　1.5　统计学分析　组间比较采用Fisher直接法、p53基因突变与生存率关系的比较采用Kaplan-Meier法进行统计学分析，均由Stat View软件包处理。

　　2　结果

　　70例60岁以上老年膀胱肿瘤病人均经病理证实为原发性膀胱移行上皮癌。按国际TNM分期结果为pTa组8例、pT₁组21例，pT₂组18例，pT₃组12例，pT₄组11例，病理分级结果为gradeⅠ组9例，gradeⅡ组32例，gradeⅢ组29例。男性56例，女性14例。PCR-SSCP分析结果显示70例膀胱移行上皮癌组织中24例出现p53基因外显子5～8异常电泳条带(图1)。这24例均经PCR-直接循环测序证实为突变，突变形式以点突变为主，24例中22例为点突变，占91.7%，1例表现为1个对碱基丢失、1例表现为1个碱基对插入突变。其中发生于外显子8(密码子261～306)的13例突变均位于密码子266～285区域。图1为p53基因外显子8的PCR-SSCP分析结果，图2为PCR-直接循环测序结果。

图1　p53基因第6外显子PCR-SSCP分析，第6号

　　病例显示异常电泳带，如箭头所示

　　p53基因突变与临床分期及病理分级程度比较结果为：pTa组8例中1例(12.5%)，pT₁组21例中4例(19.0%)，pT₂组18例中7例(38.9%)，pT₃组12例中7例(58.3%)，pT₄组11例中5例(45.5%)，侵润性(pT₂～pT₄)组较浅表性癌(pTa～pT₁)组p53基因突变明显增高(P＝0.020)，gradeⅠ级组9例中0例，gradeⅡ级组32例中8例(25.0%)，gradeⅢ级组29例中16例(55.2%)，gradeⅡ～Ⅲ级组比gradeⅠ级组突变明显增高(P＝0.023)。p53基因突变阳性组与无突变组的1年、3年、5年生存率分别为63.6%、40.1%、40.1%及91.8%、76.4%、56.4%，突变阳性组较无突变组术后生存率明显下降(P＝0.021，图3)。

图2　p53基因第6外显子PCR-SSCP分析显示第6号

　　病例异常，PCR-直接循环测序结果证实第196号

　　密码子(C196)碱基由CGA突变为TGA，导致

　　该密码子由指导精氨酸合成突变为终止密码子

图3　p53基因突变与老年人膀胱癌生存率

　　3　讨论

　　p53基因定位于染色体17p13.1上，是与DNA修复、细胞凋亡密切相关的多功能基因，亦是目前在人类恶性肿瘤中研究最为广泛的抑癌基因之一。一般认为p53基因通过两个途径而发挥其细胞增殖抑制作用，一条通路是当DNA发生损伤时，直到损伤部位完全修复为止，p53基因使细胞周期停止在G1期；另一条通路是DNA损伤部位不能修复的情况下，p53基因诱导细胞凋亡^〔4，5〕。

　　由于基因突变分析影响因素较多，且有一定的技术难度，故目前国内关于p53基因突变的研究大多限于p53蛋白的免疫组化分析。我们利用PCR-SSCP及PCR-直接循环测序法研究结果显示，60岁以上老年膀胱移行上皮癌，随临床分期及病理分级程度的增高，p53基因突变率呈明显升高趋势，提示p53基因突变是60岁以上老年膀胱移行上皮癌的晚期事件，可能与膀胱癌的进展密切相关。因此，我们认为p53基因突变可作为预测老年膀胱癌恶性进展及鉴别浸润性与浅表性膀胱癌有效的分子生物学指标。

　　人类恶性肿瘤p53基因突变多发生于外显子5～8区域，特别是集中于密码子117～142、171～181、234～258及270～286四个突变热点区^〔6～8〕。我们分析结果显示，发生p53基因突变的24例中有13例突变位于外显子8(密码子261～306)的266～285区域，提示此区域的p53基因突变可能在60岁以上老年人的膀胱移行上皮癌中具有重要意义。

　　乳腺癌、结肠癌、肺癌^〔1～3〕等恶性肿瘤p53基因的异常改变提示预后不良。目前尚未见到老年人膀胱癌预后与p53基因异常的确切关系的报告。我们通过长期随访观察，注意到p53基因突变阳性组与无突变组的1年、3年、5年生存率分别为63.6%、40.1%、40.1%及91.8%、76.4%、56.4%，突变阳性组较无突变组术后生存率明显下降(P＝0.021)。因此，我们认为p53基因突变及临床分级可作为老年人膀胱癌预后的判断指标。

　　1　本课题受教育部留学回国人员科研启动基金资助

　　作者简介：王洪亮，男，35岁，主治医师，博士生

　　4　参考文献

　　1　Iwaya K, Tsuda H, Tamiki K et al.Nuclear p53 immol/luminoreaction associated with poor prognosis of breast cancer.Jpn J Cancer Res，1991；82：835

　　2　Hamelin R, Laurent PP, Olschwang S et al.Association of p53 mutations with short survival in colorectal cancer.Gastroenterolo-

　　gy，1994；106：42

　　3　Hiyoshi H, Matsuno Y, Kato H et al.Clinicopathological singnificance of nuclear accumulation of tumor suppressor gene p53 product in primary lung cancer.Jpn J Cancer Res，1992；82：101

　　4　Yin C, Knudson CM, Korsmeyer SJ et al.Bax suppress tumorgenetics and stimulates apotosis in vivo.Nature，1997；385：637

　　5　Morgan SE, Kastan MB.p53 and ATM:Call cycle, cell death, and cancer.Adv Cancer Res，1997；71：1

　　6　Greenblatt MS， Bennett WP, Hollstein M et al.Mutations in the p53 tumor suppressor gene: Clues to cancer etiology and molecular pathoenesis.Cancer Res，1994；54：4855

　　7　Harris CC.Structure and function of the p53 tumor suppressor gene: Clues for rational cancer therapeutic strategies.J Natl Cancer Inst，1996；88：1442

　　8　Soussi T, May P.Structural aspects of the p53 protein in relation to gene evolution: A second look.J Mol Biol，1996；260：623

1998-08-27收稿

　　1999-07-29修回