多药耐药相关蛋白和P-糖蛋白在膀胱癌表达的意义

中华泌尿外科杂志 1998年第7期第19卷 论　　著

作者：陈忠　章咏裳　李家贵　张永幸

单位：430030　武汉，同济医科大学附属同济医院泌尿外科(陈忠、章咏裳、李家贵)；同济医科大学公共卫生学院(张永幸)

　　关键词： 膀胱肿瘤；癌；药物耐受性；免疫化学

　　摘要　应用免疫组化法研究40例膀胱移行细胞癌及6例正常膀胱粘膜标本多药耐药相关蛋白(MRP)、P-糖蛋白(P-gp)的表达。结果：40例膀胱肿瘤中MRP、P-gp的阳性率分别为52.5%、57.5%，其中G₁、G₂、G₃肿瘤阳性率分别为46.3%、38.5%；52.9%、39.8%；60.0%、80.0%。24例初发肿瘤标本阳性率为37.5%、41.7%，16例化疗后复发肿瘤标本阳性率为75.0%、81.3%。结果提示MRP、P-gp表达量随肿瘤级别增高呈表达增强的趋势，复发病人的阳性率显著增高(P＜0.05)。这两种蛋白的表达可能是膀胱腔内化疗失败的重要原因。

　　Expression of multidrug-associated protein and P-glycoprotein in bladder cancer　Chen Zhong, Zhang Yongshang,Li Jiagui, et al. Department of Urology, Tongji Hospital, Tongji Medical University, Wuhan 430030

　　Abstract　Protein product of multidrug-associated protein(MRP) and P-glycoprotein(P-gp) were detected by immunohistochemical method in 40 specimens of transition cell bladder carcinoma and in 6 normal bladder mucosa as control. MRP was positive in 21(52.5%) and P-gp being positive in 23 of 40(57.5%). In the control group, MRP was positive in 2 and P-gp positive in 1. The MRP and P-gp positive rates in grade Ⅰ,Ⅱ and Ⅲ tumors were 46.3%、38.5%,52.9%、39.8% and 60.0%、80.0%. The MRP and P-gp positive rate in primary tumor specimens were 37.5% and 41.7%, and in recurrent specimens treated by chemotherapy were 75.0% and 81.3%. The results suggested the MRP and P-gp positive rates were higher in high grade tumors and significantly higher in recurrent patients. It is probable that MRP or P-gp is one of the important factors that leads to chemotherapy failure.

　　Key words　Bladder neoplasms　　Carcinoma　　Drug tolerance　　Immunochemistry

　　膀胱肿瘤切除术结合膀胱腔内化疗药物灌注能明显改善患者预后，但仍有40%～80%的复发率，其中10%的患者有肿瘤分期或分级进展。多药耐受性(MDR)是导致化疗失败的重要原因之一。MDR是指肿瘤细胞在治疗过程中对一种化疗药物产生耐药性，同时对其它非同类型的多种药物亦产生耐药性。P-糖蛋白(P-gp)是引起MDR现象最常见的因素之一，而近来发现的多药耐药相关蛋白(MRP)在MDR中也起重要作用。本研究通过免疫组化方法，分析MRP、P-gp在膀胱肿瘤中表达及与膀胱肿瘤生物学行为之间的关系。

　　材料与方法

　　一、研究对象

　　以我院1992～1996年间经手术证实的膀胱移行细胞癌石蜡块标本为研究对象，按WHO病理组织学分级标准：G₁ 13例，G₂ 17例，G₃ 10例；其中初发24例，膀胱腔内灌注化疗药物化疗后复发16例，单发13例，多发27例。另取6例膀胱粘膜组织作为正常对照。

　　二、主要试剂

　　MRP单抗QCRL-1由加拿大Susan Cole惠赠^［1］，P-gp单抗C219购自武汉博士得公司。

　　三、免疫组织化学染色

　　采用SABC法进行免疫组化染色，即用型SABC试剂盒由博士得公司提供，联苯二胺显色，甲基绿液复染。

　　四、统计结果

　　根据免疫组化染色的程度、范围和分布进行判断，具体标准如下：阴性(-)：整个切片反应在10%以下；轻度阳性(+)：整个切片10%～70%为阳性；强阳性(++)：整个切片＞70%为阳性。统计处理：χ²检验。

　　结　　果

　　40例移行细胞癌中，有21例(52.5%)MRP阳性，23例(57.5%)P-gp阳性。阳性显色为棕黄色，主要位于细胞膜和细胞浆中，其中MRP有5例表现为细胞核染色阳性(G₂ 2例，G₃ 3例)。两种蛋白共同阳性16例，共同阴性12例，两者在实验对象中的表达无相关性。6例正常膀胱粘膜的MRP、P-gp分别有2例和1例轻度阳性。

　　两种蛋白在病理分级间、初发与复发间及单发与多发间比较见附表。其中，病理分级中比较，仅MRP在G₁、G₃间的表达有显著性差异(P＜0.05)，而在初发与复发之间、单发与多发之间均有显著性差异(P＜0.05)。

附表　MRP、P-gp表达与膀胱肿瘤生物学行为间关系

　　讨　　论　　膀胱肿瘤具有易复发的生物学特征，术后用药物膀胱腔内灌注治疗能明显改善预后。但化疗仍存在许多问题，其中MDR是化疗失败的重要因素之一，因此MDR成为近年来肿瘤临床和基础研究中的热点。多种因素可引起MDR，其中人们研究最多、最广的是P-糖蛋白机制，但P-gp不是产生MDR的唯一机制，还有许多其它蛋白也参与调节细胞内的药物浓度，如MRP、肺耐药相关蛋白(LRP)等，某些靶酶如拓扑异构酶Ⅱ量的改变也与MDR有关。由于国内甚少有MRP的报道，故本实验通过免疫组化方法，重点观察和讨论MRP在膀胱移行细胞癌中的表达与其生物学关系。

　　1989年Mc Grath在经阿霉素(ADM)诱导的不表达P-gp的人类早幼粒细胞白血病耐药株HL 60

　　/ADM细胞膜蛋白组分中发现了一种与耐药有关、分子量为190 000的蛋白质，命名为多药耐药相

　　关蛋白，即MRP。Cole等^［2］从小细胞肺癌耐药细胞株H69AR中分离出MRP、MRPmRNA，通过

　　氨基酸测序分析，发现MRP与P-gp一样，属具有ATP结合域的跨膜转运蛋白超家族成员，与P-gp

　　的同源性为14%，这个家族成员能量依赖性的转运各种分子通过细胞膜。表达MRP、P-gp的细胞

　　有相似的耐药谱，如均对ADM、表阿霉素、柔红霉素、鬼臼噻吩甙、长春新碱、长春花碱、放

　　线菌素D、秋水仙素等耐药，但对烷化剂如丝裂霉素C、氮芥、顺铂、噻口　替哌及喜树碱等则

　　敏感^［3］。MRP引起的耐药机制虽与P-gp相似，但并不完全相同。MRP在细胞内及胞膜上均有

　　表达，可以引起细胞内药物外排增加，细胞内药物浓度下降，这种转运作用是可以饱和的，此

　　外还可引起细胞内药物分布发生改变，接触靶位点的药物减少^［4］。

　　国内外已陆续报道了P-gp与膀胱肿瘤生物学行为之间的关系。本实验中P-gp在细胞中的分布与韩瑞发等^［5］报道一致。而资料报道不多的MRP，我们发现它从细胞膜至胞浆、胞核均有表达，且5例核阳性均出现在肿瘤分级较高的病例(G₂ 2例，G₃ 3例)。Flens等^［6］通过单抗MRPr 1进行免疫组化分析，发现MRP在皮肤、胰腺、肠上皮、睾丸内皮细胞和膀胱移行细胞上皮及肌层等正常组织中，以及肺癌、卵巢癌、神经胶质瘤等多种肿瘤组织中均有表达，但前者MRP阳性染色主要位于细胞浆中，而肿瘤细胞膜上有强阳性表达。本实验出现核阳性结果，可能与抗体的识别位点和测试方法的差异有关。Rhodes等^［4］用荧光显微镜观察柔红霉素在人类肺癌细胞株COR-123/P及耐药株COR-123/R中的分布，前者药物主要位于细胞核内，耐药株中，药物首先进入细胞核内，很快排出胞核，分布在细胞核周围的小囊泡中，由此可见，MRP分布在核膜上也是有可能的。

　　MRP、P-gp在正常膀胱粘膜有弱阳性表达，肿瘤标本中表达量随级别增高呈表达增强的趋

　　势，但仅MRP在G₁、G₃间的表达有显著性差异。初次发病的膀胱肿瘤标本即可有MRP、P-gp表

　　达，但初发病人与复发病人相比，后者阳性表达率显著增高。这一方面说明化疗药物能诱导耐

　　药蛋白的表达，引起MDR，导致化疗失败。另一方面也说明MRP、P-gp在正常膀胱粘膜和未经

　　治疗的膀胱肿瘤中亦有广泛分布。本实验MRP、P-gp在膀胱肿瘤标本中的阳性表达无相关性，

　　与Clifford等^［7］的结论相同。这说明两者虽都属相同蛋白家族，但两者的诱导和表达可能存在

　　不同的机制。因此临床上制定化疗方案前，可首先测定有无耐药蛋白的表达，避免采用MRP、

　　P-gp耐药谱中药物，治疗过程中，采取一定措施，减少或扭转MRP、P-gp表达。MRP、P-gp在

　　单发和多发肿瘤之间表达的差异原因尚不清楚。

　　体外研究表明，只有蒽环类抗生素和鬼臼乙叉甙类抗肿瘤药物方能诱导MRP表达^［3］。但本组资料中，有2例患者初发时肿瘤标本MRP表达阴性，经噻口　替哌治疗复发时MRP表达阳性，这可能与体内药物诱导MRP表达机制更为复杂有关。

　　引起膀胱肿瘤产生耐药性的因素和机制是多方面的，ADM、长春新碱能诱导MRP、P-gp的

　　表达，丝裂霉素C、顺铂等烷化剂亦能通过其他途径产生耐药性^［8］。使用钙离子阻断剂能逆转

　　P-gp等介导的MDR。化疗药物间联合应用或与细胞因子如干扰素等使用能增强疗效。因此，膀

　　胱肿瘤术后制定化疗方案时，应结合患者实际情况，制定个体化方案，治疗过程中，除常规随

　　访检查外，对复发患者，应积极寻找复发原因，既考虑P-gp因素，又要顾及MRP所致之因素，及

　　时更改治疗方案，以便取得更好疗效。

　　参　考　文　献

　　1　David RH, Stephan DG, Roger GD, et al. Detection of the Mr 190 000 multidrug resistance protein, MRP, with monoclonal antibodies. Cancer Res, 1994,54∶5788-5792.

　　2　Cole SPC, Bhardwaj G, Gerlach JH, et al. Overexpression of a transporter gene in a multidrug-resistant human lung cancer cell Line. Science, 1992,258∶1650-1655.

　　3　Slapak CA, Fracasso PM, Martell RL, et al. Overexpression of the multidrug resistance-associated protein(MRP) gene in vincristine but not doxorubicin-selected multidrug-resistance murine. Cancer Res, 1994,54∶5607-5613.

　　4　Rhodes T, Barrand MA, Twentyman PR, et al. Modification by brefeldin A, bafilomycin A, and 7-chloro-4-nitrobenz-2-oxa-1, s-diazole(NBO) of cellular distribution of anthracyclines in the non-p-glycoprotein-mediated multidrug-resistant cell line COR-L23/R. Br J Cancer, 1994,70∶60-66.

　　5　韩瑞发，吴长利，张广建，等．膀胱癌多向耐药基因P-GP₁₇₀表达的研究.中华泌尿外科杂志，1994，15∶419-421.

　　6　Flens MJ, Zaman GJR, Valk P, et al. Tissue distribution of the multidrug resistance protein. Am J Pathol, 1996,148∶1237-1247.

　　7　Clifford SC, Neal DE, Lunee J. Alterations in express of the multidrug resistance-associated protein(MRP) gene in high-grade transitional carcinoma of the bladder. Br J Cancer, 1996,73∶659-666.

　　8　Xu BH, Gnpta V, Singh SV, et al. Mechanism of differential of human bladder cancer cells to mitomycin C and its analogue. Br J Cancer, 1996, 69∶242-246.

(收稿：1997-08-11)