PCR-SSCP银染色法检测膀胱癌患者尿脱落细胞P53基因突变

中华泌尿外科杂志 1998年第11期第19卷 论　著

作者：夏溟　臧美孚

单位：100730 中国协和医科大学，中国医学科学院，北京协和医院泌尿外科

　　关键词： 膀胱肿瘤；癌；基因；免疫酶技术

　　摘要　采用PCR-SSCP银染色法检测58例膀胱移行细胞癌患者尿脱落细胞P53基因5-8外显子突变。结果发现健康者和非膀胱癌患者的尿脱落细胞均无P53基因突变，19例膀胱癌患者尿脱落细胞存在P53基因突变，其中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级膀胱癌分别为0%(0/16)，25%(7/28)和86%(12/14)，P＜0.01；表浅性(PTis～T₁)和浸润性膀胱癌(PT₂-T₄)分别为11%(4/36)和68%(15/22)，P＜0.01；初发和复发膀胱癌分别为9%(2/22)和47%(17/36)，P＜0.01；单发和多发膀胱癌分别为31%(12/39)和37%(7/19)，P＞0.05。结论：PCR-SSCP银染色法是一种可靠、快速、实用的P53基因突变检测方法。P53基因突变主要发生在高级、期的膀胱癌，与膀胱癌的早期复发有密切关系，而与其多灶性无关。P53基因突变的检测对预测膀胱癌的进展，复发的早期诊断具有重要的临床意义。

　　Detection of P53 tumor suppressor gene in urine exfoliated cells of bladder cancer patients　Xia Ming,Zang Meifu.Department of Urology,Peking Union Medical College Hosptial,Chinese Academy of Medical Sciences,Beijing 100730

　　Abstract　P53 tumor suppressor gene mutation (exon 5-8) in urine exfoliated cells of 58 bladder transitional cell carcinoma patients was measured by PCR-SSCP silver staining tecthnique.No P53 gene mutation was detected in normal healthy individuals or in nontumor bearing patients with bladder diseases while it was detected in 19 bladder cancer patients being 0%(0/16) in grade Ⅰ tumor,25% (7/28) in grade Ⅱ and 86%(12/14) in grade Ⅲ (P＜0.01).P53 gene mutation was detected in 11% (4/36) of superficial tumors (PTis-T₁) and in 47% (15/22) of invasive ones (P＜0.01),in 9% (2/22) of initial tumors and in 37%(17/36) of recurrent tumors (P＜0.01).No significant difference of P53 gene mutation was found between single tumor (31%,12/39) and multiple tumors (37%,7/19) (P＞0.05).It was concluded that PCR-SSCP silver staining method for the detection of P53 gene mutation is quick reliable and practical.P53 gene mutation appears to be closely associated with high grade and high stage bladder cancers and is also related to recurrence but not to multifocality.The detection of P53 gene mutation plays an important role in predicting the malignant progression of bladder cancer and in early detection of bladder cancer recurrence.

　　Key words　Bladder neoplasms　　Carcinoma　　Genes　　Immunoenzyme technics

　　在膀胱癌基因诊断研究中，许多学者试图从患者尿脱落细胞分析其基因的分子生物学改变，从而预测肿瘤临床生物学行为。这是目前膀胱癌研究的一个重要方向^［1，2］。本研究采用PCR-SSCP银染色法检测膀胱癌患者尿脱落细胞P53基因突变，并结合本组病例临床和病理资料分析，旨在探讨P53基因突变与膀胱癌生物学行为的关系及该方法的临床应用价值。

　　材料与方法

　　一、临床资料

　　收集58例经手术病理证实的膀胱移行细胞癌患者术前尿脱落细胞为研究组，年龄52～83岁，平均62.3岁；男45例，女13例。10例正常健康者和10例非泌尿系肿瘤患者的尿脱落细胞为对照组，年龄48～85岁，平均66.5岁；男14例，女6例。58例膀胱移行细胞癌按UICC和WHO标准评定Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级肿瘤分别为16例，28例，14例；PTis、PTa、PT₁、PT₂、PT_3～4期肿瘤分别为2例、14例、20例、12例、10例。58例患者初发和复发肿瘤分别为22例、36例。单发性和多灶性肿瘤分别为39例、19例。

　　二、尿脱落细胞的收集与处理

　　分别取膀胱癌患者术前和对照组每人清晨第二次尿液200ml，离心收集尿脱落细胞，酚氯仿法提取每人份尿脱落细胞基因组DNA，用TE液溶解基因组DNA，测定OD 260/OD 280比值，确定其纯度并定量，保存备用。

　　三、主要试剂与研究方法

　　1.引物：根据文献报道的P53基因序列，设计引物^［3］，由北京中山生物有限公司合成P53基因5、6、7、8外显子，引物序列如下：1.exon 5(181bp)，primer 1：5′-TACTCCCCTGCCCTCAACAAGA-3′:Primer 2:5′-CGCTATCTGAGCAGCGCTCATG-3′;2.exon 6(132bp):primer 1:5′-GATTGCTCTTAGGTC

　　TGGCCCCT-3′:primer 2:5′-CAGACCTCAGGC

　　GGCTCATAGG-3′;3.exon7 (119bp):primer

　　1:5′-CTAGGTTGGCTCTGACTGTACCACCA

　　TCC-3′;primer 2:5′-TGACCTGGAGTCTTCC

　　AGTGTG-3′;4.exon 8(173bp):primer1:5′-GGAATTCCTATCCTGAGTAGTGGTA-3′; primer

　　2:5′-GGAATTCCTGCTTGCTTACCTCG-3′。

　　2.方法：首先以尿脱落细胞基因组DNA为模板DNA，PCR扩增P53基因5、6、7、8外显子特异性片段。PCR反应条件：95℃预变性5分钟，然后94℃ 30秒→55℃，30秒→72℃，1分钟，反复循环35次，72℃延伸7分钟。再以PBR 322/Hinf-Ⅰ为分子量标准，2%琼脂糖凝胶电泳，鉴定PCR扩增产物。最后取PCR产物2μl，加甲酰胺变性缓冲液8μl，95℃变性5～10分钟后，立即置冰中，取10μl变性后的PCR产物上样，以8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，条件是室温，恒压200伏，电泳2～3小时，再用银染液固定20～30分钟，染色30分钟，显影30分钟，定影2～3分钟后，取出凝胶块，双蒸水冲洗干净，干燥后即可在灯箱上进行SSCP结果分析。

结　　果

　　本组58例中有19例发生P53基因突变，占32.8%。对照组未发现1例存在P53基因突变，结合临床及病理资料分析，P53基因突变与肿瘤分级、分期的关系见表1。与肿瘤多灶性生长和复发的关系见表2。19例P53基因突变分别发生在exon 5者3例，exon 7者5例，exon 8者11例；未发现exon 6突变。

表1　P53基因突变与膀胱癌病理

　　分级、分期的关系

表2　P53基因突变与膀胱癌复发

　　和多灶性的关系

　　讨　　论

　　一、PCR-SSCP银染色法检测P53基因突变的优点

　　目前，许多研究者根据P53基因突变过程，采用RFLP、FISH、PCR-SSCP，DNA顺序，Southern印迹杂交和免疫组化等方法，从不同水平来检测P53基因突变。应用最多的是免疫组织化学法，PCR-SSCP和DNA测序^［3～6］。免疫组化法需采用抗突变型P53蛋白的特异性抗体，由于此类抗体的特异性仍存在问题，在某些情况下可与野生型P53蛋白结合，同时有些P53基因突变并非导致突变型P53蛋白的产生，以及一些技术性因素影响，如固定剂种类不同可使突变型P53蛋白结构改变，从而使检测特异性和敏感性降低。此外，由于P53基因存在无义突变，可产生缺乏核定位信号作用的短末端P53蛋白，如果免疫组化染色不存在核免疫反应活性，并不能排除P53基因突变^［6］。PCR-SSCP和DNA测序目前已被多数研究者看作为检测P53基因突变的“金标准”，但需用放射性同位素，且操作复杂费时，不易临床推广。因此，我们采用PCR-SSCP银染色法检测P53基因突变，该方法是在Orita等的研究基础上加以改进建立的^［7］。研究结果发现本组膀胱移行细胞癌尿脱落细胞P53基因的突变率为32.8%(19/58)，突变发生的热点在7、8外显子，尤其8外显子，占57.9%(11/19)，与其他学者采用其它方法检测P53基因突变的结果相近^{［5，7，8］}。在具体检测过程中，我们体会该法具有下述优点：(1)特异性和敏感性高；(2)不需用放射性同位素，所需标本量少；(3)操作方便快速，一般7～8小时内可获结果。因此，我们认为该法具有临床实用价值，易于推广，适合于膀胱肿瘤的早期基因诊断和临床随访。

　　二、P53基因突变与膀胱癌分级，分期的关系

　　在本研究中，我们发现Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级膀胱癌P53基因突变率分别为0%，25%和86%，P＜0.01；表浅性膀胱癌(PTis～PT₁)和浸润性膀胱癌(PT₂～T₄)P53基因突变率分别为11%和68%，P＜0.01。提示P53基因突变主要发生在高级、期的膀胱癌。Esrig等^［7］将17p13.1的LOH与P53基因突变进行比较，发现P53基因突变的16例膀胱癌中有15例(93%)存在，表明P53基因突变与17P13.1的LOH有密切相关性。Olumi等^［9］研究发现30例Ⅲ级膀胱癌有20例发生17p13.1的LOH，而10例Ⅱ级膀胱癌无1例存在17P13.1的LOH。由此可从分子遗传学角度说明P53基因突变与膀胱癌分级有密切关系。Watanable等^［10］采用免疫组化法对69例膀胱移行细胞癌标本行P53蛋白表达的检测，结果Ⅱ、Ⅲ级肿瘤P53蛋白染色阳性率分别为38.2%和52.1%，PTis～PT₁和PT₂～PT₄肿瘤分别为20.0%和56.3%，P＜0.05，表明P53蛋白过度表达与高级期膀胱癌有密切关系。Fujimoto等^［11］采用PCR-SSCP检测25例膀胱癌P53基因4～11外显子，结果13例表浅性膀胱癌仅1例发生P53基因突变，12例浸润性膀胱癌有6例发生P53基因突变；Ⅰ、Ⅱ级膀胱癌10例中无1例存在P53基因突变，Ⅲ级15例膀胱癌中有8例发生P53基因突变。因此，我们认为P53基因突变可作为预测膀胱癌恶性进展和鉴别表浅性与浸润性膀胱癌有用的基因分子生物学标记。

　　三、P53基因突变与膀胱癌复发和多灶性的关系

　　本研究结果提示初发膀胱癌P53基因突变率为9%，而复发膀胱癌为47%，表明P53基因突变与膀胱癌复发有密切关系。Fradet等^［12］对271例膀胱移行细胞癌患者随访1年，发现P53蛋白表达阳性者初次复发时间早，而P53蛋白表达阴性者初次复发时间晚。Esrig等^［13］对243例膀胱移行细胞癌患者随访6年，发现PT₁患者P53基因突变阳性与阴性两组的5年复发率分别为64%和9%，PT₂患者分别为56%和16%，PT₃患者分别为71%和17%。由此可见，P53基因突变的膀胱癌复发早，且复发率高。P53基因突变可作为预测膀胱癌复发的一个有价值的分子生物学指标。

　　本研究中，我们亦观察了P53基因突变与膀胱癌多灶性的关系，发现单发瘤和多发瘤的P53基因突变分别为31%和37%，提示P53基因突变可能与膀胱癌多灶性生长无明显关系。

　　参　考　文　献

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　　本课题受吴阶平泌尿外科医学基金资助

(收稿：1998-03-13)