nm23-H1基因与恶性及半恶性骨肿瘤相关性的初步报告
中华外科杂志 1998年第8期第36卷 临床研究
作者：哈力南 郭卫 冯传汉 李贺平
单位：100034 北京医科大学附属人民医院骨肿瘤研究室
关键词：基因表达；骨肿瘤；原位杂交；免疫组织化学
【摘要】 目的 探讨nm23-H1基因与恶性及半恶性骨肿瘤相关性。 方法 以30例骨肿瘤手术切除组织为标本，分别进行nm23-H1 mRNA原位杂交及单克隆抗体的免疫组化研究。 结果 nm23-H1基因的表达在骨巨细胞瘤4例原发者中为阳性，3例复发者中为阴性；在8例骨肉瘤中6例阳性；在Ewing瘤、恶性纤维组织细胞瘤及转移癌中表达基本为阴性；在4例软骨肉瘤中3例阴性。 结论 nm23-H1的表达可能与骨巨细胞瘤的复发有一定相关性，而在骨肉瘤的研究中未发现其相关性。
Association of nm23-H1 with orthopedic oncological conditions Ha Linan，Guo Wei，Feng Chuanhan，et al.Bone Tumor Laboratory，People's Hospital，Beijing Medical University,Beijing 100044．
【Abstract】 Objective To explore the correlation between nm23-H1 gene and malignant and semi-malignant bone tumors. Method Thirty surgical specimens were collected,including 8 osteosarcomas,7 giant cell tumors,4 chondrosarcomas,2 Ewings sarcomas,2 malignant fibrohistocytomas,1 neurofibrosarcoma,1 schwannoma,and 5 metastatic cancers.The expression of nm23-H1 in these specimens was observed by in situ hybridization and immunohistochemical staining. Result The expression of nm23-H1 in 4 cases of primary giant cell tumor (GCT) was high,but was low or absent in 3 recurrent ones.In 4 cases of chondrosarcomas, the expression was positive.Its expression was basically negative in Ewings tumor,malignant fibrous histiocytoma and metastatic sarcomas. Conclusion There is no association of nm23-H1 with osteosarcoma.
【Key words】 Gene expression Bone neoplasms In situ hybridization Immunohistochemistry
近年来，nm23基因在肿瘤转移中的作用已逐渐为人们所认识［1］，其中nm23-H1被认为对肿瘤转移有抑制作用［2］。已有研究证明，在乳腺癌、肝细胞癌、卵巢癌患者中，预后不良均与nm23-H1表达减低相关［3～5］。也有报道指出，在有些肿瘤中nm23-H1表达与预后无任何相关性［2］。目前尚无证据显示nm23-H1与恶性骨肿瘤的类别、病理分型、预后等有相关性。我们选取30例骨肿瘤病例的手术标本，进行了nm23-H1 mRNA原位杂交及单克隆抗体免疫组化研究，现报告如下。
材料与方法
1.实验材料：以我院骨肿瘤科1996年11月～1997年9月手术切除的30例经石蜡包埋处理的骨肿瘤组织为标本(表1)。其中男14例，女16例，平均年龄为33.3岁；肿瘤部位：胫骨上端11例，骶骨10例，椎体4例，股骨下段2例，股骨上端2例，股骨中段1例。
表1 30例肿瘤标本一般资料(例)
| 项目 |
骨肉瘤 |
GCT |
软骨肉瘤 |
Ewing瘤 |
MFH |
转移癌 |
NS |
| 总例数 |
8 |
7 |
4 |
2 |
2 |
5 |
2 |
| 化疗 |
7 |
0 |
1 |
1 |
2 |
1 |
1 |
| 大肿瘤 |
5 |
3 |
2 |
2 |
0 |
1 |
2 |
| 浸润周边 |
6 |
0 |
2 |
2 |
0 |
5 |
1 |
| 复发标本 |
2 |
3 |
2 |
0 |
1 |
0 |
1 |
| 远处转移 |
4 |
0 |
0 |
0 |
0 |
5 |
1 |
注：GCT：骨巨细胞瘤；MFH：恶性纤维组织细胞瘤；NS：神经系统肿瘤；大肿瘤：直径大于所侵犯骨直径的4倍
探针为nm23-H1 BamH1 900bp片段(天象人生物制品公司)；以地高辛标记进行原位杂交(北京医科大学病理教研室)。抗体为抗nm23-H1小鼠单抗IgG2a(santa cruz biotechnology)。碱性磷酸酶显色系统(北京医科大学病理教研室)用于mRNA原位杂交。DAB显色系统(中山生物制品公司)用于免疫组化研究。
2.nm23-H1 mRNA原位杂交：取福尔马林固定、石蜡包埋的标本，在无RNA酶的条件下，经二甲苯脱蜡、乙醇上水、蛋白酶K消化、4%多聚甲醛固定后，1∶400的乙酸酐∶三乙醇胺10分钟，预杂交(42℃4小时)，以15 ng/ml的探针浓度滴加杂交液，42℃16小时杂交。地高辛抗体杂交，4℃过夜，以0.5 mM MgCl2，pH9.5孵育2分钟后，NBT、BCIP避光显色0.5～2小时。甲基绿复染、脱水、透明、封片。以预杂交液替代杂交液作为阴性对照。
3.nm23-H1单克隆抗体杂交：取福尔马林固定、石蜡包埋的标本，经二甲苯脱蜡，乙醇上水后，3%H2O2孵育15分钟，0.1%胰酶消化40分钟，滴加1∶100稀释的抗nm23-H1小鼠单抗IgG2a4℃杂交过夜，分别与抗鼠Bio-IgG 及酶标辣根过氧化物酶亲合素杂交40分钟后，DAB避光显色2～5分钟，苏木素复染、脱水、透明、封片。以封闭血清代替抗nm23-H1小鼠单抗IgG2a作为阴性对照。
结 果
nm23-H1 mRNA原位杂交：对每例标本均在高倍视野中选取其左上、右上、左下、右下及中心部位各100个肿瘤细胞观察。凡胞浆出现蓝色染色即为阳性细胞；阳性细胞比例＞25%者为阳性。本组30例中阳性者15例，阳性率为50%(图1～4)。
图1 原发骨巨细胞瘤，nm23-HI原位杂交阳性染色，可见胞浆内蓝紫色沉淀（甲基绿复染胞核，×40）
图2 复发骨巨细胞瘤，nm23-HI原位杂交阴性染色（甲基绿复染胞核，×40）
图3 伴肺部转移的骨肉瘤，nm23-HI原位杂交性染色，可见胞浆内蓝紫色沉淀（甲基绿复染胞核，×40）
图4 原发、无远处转移的成纤维型骨肉瘤，nm23-HI原位杂交性染色，可见胞浆内蓝紫色沉淀（甲基绿复染胞核，×40）
nm23-H1单克隆抗体杂交：计数阳性结果判定方法同上，凡胞浆出现棕色染色为阳性。本组30例中阳性者19例，阳性率为63.33%(图5，6)。
图5 骨母细胞型骨肉瘤的肺转移灶，nm23-HI单克隆抗体杂交阳性染色，可见胞浆内棕色沉淀（苏木素复染胞核，×40）
图6 骨母细胞型骨肉瘤的骨原发灶，nm23-HI单克隆抗体杂交阳性染色，可见胞浆内棕色沉淀（苏木素复染胞核，×40）
不同骨肿瘤nm23-H1表达情况见表2。
讨 论
nm23-H1基因作为一种肿瘤转移抑制因子，在多种肿瘤中，其表达减低均与较差的预后及肿瘤恶性程度相关［3～6］。但在有些肿瘤中两者并无相关关系［2］。Oda和Walter［7］用nm23的多克隆抗体对骨肉瘤进行免疫组化研究，认为两者之间并无相关性。
根据本实验的研究结果，我们认为在骨巨细胞瘤中，nm23-H1的表达与其复发可能有一定相关性。本组7例Ⅰ、Ⅱ级骨巨细胞瘤，其中4例原发者中，其nm23-H1的原位杂交及免疫组化结果均为阳性，且在阳性标本中作为瘤细胞成分的纤维细胞样细胞其表达较多核巨细胞减少；3例复发GCT中，nm23-H1的表达均为阴性或仅有极少量表达（＜10%）。
表2 不同骨肿瘤nm23-H1的表达(例)
| 肿瘤类别 |
例数 |
mRNA原位杂交 |
单克隆抗体杂交 |
| 阳性 |
阴性 |
阳性 |
阴性 |
| 骨肉瘤 |
8 |
6 |
2 |
7 |
1 |
| 复发 |
2 |
2 |
0 |
2 |
0 |
| 非复发 |
6 |
4 |
2 |
5 |
1 |
| 转移 |
4 |
3 |
1 |
3 |
1 |
| 非转移 |
4 |
3 |
1 |
4 |
0 |
| |
|
|
|
|
|
| GCT |
7 |
4 |
3 |
4 |
3 |
| 原发 |
4 |
4 |
0 |
4 |
0 |
| 复发 |
3 |
0 |
3 |
0 |
3 |
| |
|
|
|
|
|
| Ewing瘤 |
2 |
0 |
2 |
0 |
2 |
| MFH |
2 |
0 |
2 |
0 |
2 |
| 软骨肉瘤 |
4 |
3 |
1 |
4 |
0 |
| NS |
2 |
1 |
1 |
1 |
1 |
| 转移癌 |
5 |
1 |
4 |
2 |
3 |
注：GCT：骨巨细胞瘤；MFH：恶性纤维组织细胞瘤；NS：神经系统肿瘤
这提示在骨巨细胞瘤中，nm23-H1的表达与GCT的复发可能呈负相关。可以认为，就骨巨细胞瘤而言，nm23-H1的表达异常可能引起其生长潜能重现而导致复发。
nm23-H1的表达在MFH、Ewing瘤及转移癌患者中基本为阴性。在4例软骨肉瘤中3例呈阳性表达。提示nm23-H1的表达可能与一些恶性骨肿瘤的恶性度呈负相关。
本研究中未发现nm23-H1的表达与骨肉瘤复发、转移有相关性。本实验对1例骨母细胞型骨肉瘤患者的原发灶与肺转移灶分别进行了mRNA原位杂交和nm23-H1单克隆抗体杂交，结果显示原发灶与肺转移灶之间无明显差异(图5，6)。
参 考 文 献
1Patricia SS,Generoso B.Evidence for a novel gene associated with low tumor metastatic potential.J National Cancer Institute,1988,80:200-204．
2MacDonald NJ,Rosa ADL.The potential role of nm23-H1 in cancer metastasis and cellular differentiation.Eur J Cancer,1995,31:1096-1100．
3Bevilacqua G,Sobel ME.Association of low nm23-H1 RNA level in human primary infiltrating ductal breast carcinoma with lymph node involvement and other histopathological indicators of high tumor metastatic potential.Cancer Res,1989,49:5185-5190．
4Kayama T,Ohtsuru A.Expression in human hepatocellular carcinoma of nucleoside diphosphate kinase,a homologue of the nm23-H1 gene product.J Natl Cancer Inst,1992,84:1349-1354．
5Qian Min,Feng Youji.Expression of antimetastic gene nm23-H1in epithelial ovarian cancer.Chin Med J,1997,110:142-144．
6Wright JA,Egan SE.The expression of the drosophila and gene during normal development and in neoplastic grain tumor caused by lgl mutations.Devel Biol,1993,158:364-379．
7Oda Y,Walter H.Immuohistochemical analysis of nm23 protein expression in bone tumor.J Cancer Res Clin Oncol,1995,101:667-673 ．
本课题受国家自然科学基金资助
编后 肿瘤的基因诊断是一项较新的技术，nm23-H1基因作为一种肿瘤的转移抑制因子，虽然在多种肿瘤中呈现低表达与较差的预后及肿瘤恶性度的相关性，但在骨肿瘤方面尚缺乏研究资料。本文的研究发现nm23-H1的表达与骨巨细胞瘤的复发以及一些原发恶性骨肿瘤的恶性度呈负相关，是一项有意义的工作，将有助于对恶性骨肿瘤的治疗及预后的评估，尤其是对一些组织形态与生物学行为并不相符的骨肿瘤(如Ⅰ级骨巨细胞瘤、近躯体中轴部位的软骨瘤)，更有探索形态与行为两者内在的联系以及指导临床治疗的价值，值得引起骨科临床工作者的充分关注。但本组病例数及病种均较少，因此本文所持观点是否具有普遍性，尚须在更多、更深入的实验观察中得以证实。
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