低浓度化学药物配合淋巴因子激活的杀伤细胞对人卵巢癌细胞体外杀伤敏感性的研究

中华妇产科杂志 1999年第3期第0卷 论　著

作者：陈蓉　潘凌亚　周生　杨秀玉　黄惠芳

单位：100730 中国医学科学院中国协和医科大学北京协和医院妇产科(陈蓉，潘凌亚，杨秀玉，黄惠芳)；军事医学科学院基础医学研究所(周生)

关键词：卵巢肿瘤；顺铂；氟尿嘧啶；杀伤细胞；淋巴因子激活

　　【摘要】　目的　探讨低浓度化学药物配合淋巴因子激活的杀伤(LAK)细胞能否增强对卵巢癌细胞的体外杀伤敏感性。方法　应用1.5 μg/ml泰素、4 μg/ml顺铂、25 μg/ml 氟尿嘧啶，与人卵巢癌细胞系SKOV3作用18小时后，采用⁵¹Cr释放法，观察SKOV3对被白细胞介素2（IL-2）激活的LAK细胞的杀伤敏感性；应用Grimm的方法，测定SKOV3细胞与LAK结合率的变化；应用流式细胞仪，检测SKOV3细胞表面粘附分子（ICAM-1）表达的变化，并与未经药物作用的SKOV3细胞进行对照。　结果经泰素、顺铂、氟尿嘧啶作用及未经药物作用的SKOV3细胞对LAK细胞的杀伤敏感性分别为29.7%、 45.9%、 37.2%及28.5%；与LAK细胞的结合率分别为20.1%、26.1%、24.9%及18.7%；SKOV3细胞表面ICAM-1表达率分别为52.5%、65.5%、68.1%及49.7%。结论　经低浓度化疗药物作用后的卵巢癌SKOV3细胞对被IL-2激活的LAK细胞的杀伤敏感性增强，其机理可能与ICAM－1表达的增加有关。

　　Cytotoxicities of Low Dose Anticancer Agents Combining Lymphokine Activated Killer Cell Against Ovarian Adenocarcinoma Cell Line SKOV3 　CHEN Rong, PAN Lingya, ZHOU Sheng, et al. Chinese Academy of Medical Sciences, Peking Union Medical College, Peking Union Medical College Hospital, Beijing 100730

　　【Abstract】　Objective　To investigate whether low-dose anticancer agents could increase the sensitivity of ovarian adenocarcinoma cell line SKOV3 to lymphokine activated killer cell (LAK).Methods　After SKOV3 cells were pretreated by low dose anticancer agents Taxol, cis-diamminedichloroplatin（CDDP）, 5-fluorouracilum（5-FU） for 18 hours, the sensitivity of SKOV3 to LAK was detected by four ⁵¹　Cr release assay. And the percentage of SKOV3 adhesion to LAK and intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) expression on SKOV3 were detected by improved Grimm's assay and FACS respectively.Results　After pretreatment of SKOV3 cell with 1.5 μg/ml Taxol, 4 μg/ml CDDP, 25 μg/ml 5-FU or without anticancer agents as control for 18 hours, the cytotoxicities of Interleukin-2 activated LAK against them were 29.7%, 45.9%, 37.2% and 28.5% respectively. The conjugation rates of SKOV3 and LAK were 20.1%, 26.1%, 24.9% and 18.7% respectively. The positive rates of ICAM-1 expression were 52.5%, 65.5%, 68.1% and 49.7% respectively. CDDP and 5-FU increased ICAM-1 expression significantly and the sensitivity of SKOV3 cell to LAK cell lysis was well related to the ICAM-1 expression.Conclusion　The results indicate that some low dose anticancer agents can increase the sensitivity of cancer cells to LAK cells and it would be useful in clinical practive.

　　【Key words】　Ovarian neoplasms　　Cisplatin　　Fluorouracil　　Killer cells, lymphokine-activated

　　在卵巢癌细胞减灭术的基础上辅以大剂量化疗，是目前临床治疗卵巢癌的主要方法。但大剂量化疗引起的骨髓抑制、肾功能损害等严重副作用，常常迫使后续化疗减量，影响了治疗效果。本研究探讨在化疗药物剂量减少的情况下，配合淋巴因子激活的杀伤（LAK）细胞治疗，能否增强对卵巢癌细胞的体外杀伤敏感性，从而为临床治疗提供实验依据。

　　材料与方法

　　一、 材料

　　人卵巢腺癌细胞株：SKOV3，购自美国组织培养库(ATCC)，由我科卵巢癌实验室冻存。

　　二、方法

　　1.细胞培养： （1）SKOV3：于含10%胎牛血清的DMEM（Dulbecco's modification of Eagle's Medium）培养液中培养，0.25%的胰酶消化、传代。(2)LAK细胞的诱导和培养：抽取健康献血员外周血，肝素抗凝后分离出淋巴细胞，加入含10%胎牛血清、重组人白细胞介素2（rhIL-2） 1 000 U/ml、植物血凝集素（PHA-P）10 μg/ml 的1640培养体系中，培养3～5天即可。

　　2.⁵¹Cr释放法测试杀伤敏感性： 根据我科实验室测定的药物敏感曲线,确定本研究选用的化疗药物浓度(杀伤细胞＜10%)为泰素1.5 μg/ml、顺铂4 μg/ml、氟尿嘧啶25 μg/ml。上述药物分别与SKOV3细胞作用（研究组）18小时，未经药物作用（对照组）的SKOV3细胞，经⁵¹Cr标记1小时，再与LAK细胞分别按100∶1,50∶1,25∶1的效靶比培养4小时，之后应用计数仪测定放射性核素闪烁计数（min^-1）。LAK细胞在自然释放孔和最大释放孔中分别为培养液和盐酸代替。

　　3.SKOV3与LAK细胞结合率测定： 应用Grimm等^［1］的方法，结合率的计算公式如下。

　　4.SKOV3细胞表面粘附分子（ICAM-1）的检测：上述浓度药物与SKOV3细胞作用18小时后，以鼠抗人ICAM-1(美国IMMUNOTECH公司产品)作为一抗，标记荧光素异硫氰酸酯（FITC）的羊抗鼠IgG（军事医学科学院产品）作为二抗依次标记，然后用3%甲醛溶液保存。第2天用流式细胞仪检测。

　　三、统计学分析

　　用χ²检验分析各研究组及对照组SKOV3细胞对LAK细胞的杀伤敏感性，与LAK细胞结合率和ICAM-1表达水平的结果。

　　结　果

　　一、SKOV3细胞形态学的变化

　　对照组SKOV3细胞为贴壁细胞，呈梭形，胞浆透明，生长旺盛，有复层化生长。研究组SKOV3细胞大部分仍贴壁生长，呈梭形，但部分细胞变圆，有漂浮倾向，胞浆内有小颗粒。尤以与顺铂作用后的SKOV3细胞变化明显。

　　二、SKOV3细胞对LAK细胞的杀伤敏感性

　　研究组SKOV3细胞对LAK细胞杀伤敏感性的变化见表1。与泰素、顺铂、氟尿嘧啶作用后的SKOV3细胞对LAK细胞杀伤敏感性均增强。经统计学处理，泰素与对照组比较，差异无显著性（P＞0.05），而顺铂、氟尿嘧啶与对照组比较，差异有极显著性(P＜0.01)。

　　　　表1　两组SKOV3细胞对LAK细胞的杀伤敏感性(%)

　　^*与对照组比较，P＞0.05　　^**与对照组比较，P＜0.01

　　三、SKOV3细胞与LAK细胞的结合率及SKOV3细胞表面ICAM-1表达

　　两组SKOV3细胞与LAK细胞结合率、SKOV3细胞ICAM-1表达率见表2。与泰素作用后的SKOV3细胞与LAK细胞结合率和SKOV3细胞ICAM-1表达率，与对照组比较，差异均无显著性（P＞0.05）。而顺铂、氟尿嘧啶作用后的SKOV3细胞与LAK细胞结合率和SKOV3细胞ICAM-1表达率，与对照组比较，差异均有极显著性(P＜0.01)。

　　　　表2　两组SKOV3细胞与LAK细胞结合率及SKOV3细胞表面ICAM-1表达率（%）

　　^*与对照组比较，P＜0.01

　　四、SKOV3细胞对LAK细胞的杀伤敏感性与SKOV3细胞ICAM-1表达的关系

　　当SKOV3细胞与LAK细胞效靶比为100∶1时,与泰素作用后的SKOV3细胞对LAK细胞的杀伤敏感性，及SKOV3细胞ICAM-1表达率，与对照组比较，差异均无显著性（P＞0.05）。而与顺铂、氟尿嘧啶作用后的SKOV3细胞对LAK细胞的杀伤敏感性，及SKOV3细胞ICAM-1表达率，与对照组比较，差异均有极显著性（P＜0.01）。见表3。

　　　　表3　 两组SKOV3细胞对LAK细胞的杀伤敏感性

　　与SKOV3细胞ICAM-1表达率（%）

　　^*与对照组比较，P＜0.01

　　讨　论

　　一、低浓度化学药物配合LAK细胞对卵巢癌SKOV3细胞的杀伤敏感性

　　被细胞因子IL-2激活的LAK细胞是具有杀伤肿瘤活性的细胞，LAK细胞对肿瘤细胞的杀伤作用不受人类主要组织相容性复合物（MHC)的限制，并可杀伤对自然杀伤细胞不敏感以及耐药的肿瘤细胞^［2］。大量的临床研究表明，IL-2和LAK细胞对晚期恶性肿瘤有一定的疗效。对化学药物被迫减量的患者配合LAK细胞的应用，不失为一个值得探讨的方法。

　　本研究初步探讨了在体外实验中，3种低浓度化学药物配合LAK细胞，对人卵巢癌SKOV3细胞的杀伤敏感性变化。结果显示，3种药物作用后的SKOV3细胞对LAK细胞杀伤敏感性均较对照组增强，经顺铂和氟尿嘧啶作用后的SKOV3细胞对LAK细胞杀伤敏感性，与对照组比较，差异有显著性。提示，对不能耐受大剂量化疗及因严重毒副反应而减少化疗用量的患者，同时辅以细胞因子，如IL-2治疗，有可能改善治疗效果。当然，本研究还需要进一步的体内研究证实。

　　二、低浓度化学药物配合LAK细胞增强对SKOV3细胞杀伤敏感性机理的探讨

　　一般认为，抗肿瘤药物预处理肿瘤细胞后，可增强肿瘤细胞对LAK细胞的杀伤敏感性，可能是因为抗肿瘤药物增加了LAK细胞在肿瘤局部的积累，或由于抗肿瘤药物抑制了DNA的合成，致肿瘤细胞膜损伤^［3，4］。LAK细胞杀伤肿瘤细胞的过程大致可分为：（1）LAK细胞主动识别靠拢和粘附包围肿瘤细胞；（2）LAK细胞攻击杀伤过程，其中粘附过程与粘附分子有关,粘附分子对LAK细胞与肿瘤细胞的结合是必要的^［5］。因此，有人提出，抗肿瘤药物致LAK细胞杀伤敏感性增强，是由于抗肿瘤药物增加了粘附分子的表达^［6］，但具体是何种粘附分子，目前仍不清楚。

　　本研究选用ICAM-1,即CD54⁺，属于整合素（intergrins）家族^［7］。应用流式细胞仪法检测各种抗肿瘤药物处理后肿瘤细胞ICAM-1的表达，结果显示，经顺铂、氟尿嘧啶作用后的SKOV3细胞ICAM-1的表达率显著高于对照组；经泰素作用后的SKOV3细胞ICAM-1的表达率，较对照组表达有增加，但统计学意义不明显。顺铂抗肿瘤的机理是与DNA交联，将细胞周期阻断于G₂期。氟尿嘧啶则为影响DNA的生物合成，为主要作用于S期的特异性药物。所以，ICAM-1表达率的增加可能也是由于细胞周期的改变所致。而泰素主要是抑制微管的聚集，所以不能增加ICAM-1的表达率。

　　ICAM-1有多种功能，除增加粘附作用外，还可活化T淋巴细胞^［7］。为明确LAK细胞敏感性增加，是否是由于ICAM-1使LAK细胞与肿瘤细胞粘附性增强所致，本研究还应用Grimm等^［1］的方法，观察了各种药物作用后SKOV3细胞与LAK细胞结合率的变化，结果与ICAM-1表达率基本一致。因此，可以认为，ICAM-1是通过增加肿瘤细胞与LAK细胞的结合，而增加了肿瘤细胞对LAK细胞杀伤的敏感性。

　　参考文献

　　1　Grimm EA, Bonavida B. Mechanism of cell-mediated cytotoxicity at the single cell level. I: estimation of cytotoxic T lymphocyte frequency and relative lytic efficiency. J Immunol， 1979,123:2861-2869.

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　　6　Springer TA. Adhesion receptors of the immune system. Nature(London)，1990,346: 425-434.

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(收稿：1998-01-26　　修回：1999-01-12)