孕激素对人卵巢癌细胞株HO8910细胞增殖及凋亡的影响
中华妇产科杂志 2000年第7期第35卷 论著
作者：胡琢瑛 邓晓谷
单位：胡琢瑛（400016 重庆医科大学附属第一医院妇产科）；邓晓谷（400016 重庆医科大学附属第一医院妇产科）
关键词： 卵巢肿瘤；孕酮；囊腺癌，浆液；脱噬作用；肿瘤细胞，培养的
【摘要】 目的 探讨孕激素(P)对人卵巢癌细胞株HO8910细胞体外增殖及凋亡的调控作用。方法 选用人卵巢癌细胞株HO8910进行体外培养，实验组中加入含不同浓度P的培养液,对照组加入等量空白培养液，采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测细胞增殖，流式细胞仪测定细胞周期和凋亡率，光学显微镜和透射电子显微镜进行形态学观察，终末脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法(TUNEL)计数凋亡细胞，流式细胞仪间接免疫荧光技术分析细胞内bcl-2蛋白的表达。结果 P浓度为1×10-7～1×10-5 mol/L时，作用24、48、72 h均明显抑制HO8910细胞的增殖(P均＜0.01)，并具有剂量依赖性。P作用后G0/G1期细胞增加，并伴随G0/G1期细胞的增加，出现细胞凋亡峰和凋亡率的升高（P＜0.01）；当P浓度为1×10-6、1×10-5 mol/L时，作用72 h后的细胞凋亡率分别为10.38%和35.78%,两者比较，差异有极显著性（P＜0.01）。凋亡细胞计数，当P浓度为1×10-5 mol/L时，8孔中7孔（7/8）为凋亡细胞阳性，明显多于对照组(P＜0.05)。光学显微镜和透射电子显微镜可观察到细胞凋亡的形态学改变。细胞内bcl-2 蛋白表达检测显示，当P浓度为1×10-6 mol/L时，bcl-2蛋白表达率为61.25%,明显低于对照组的71.07%(P＜0.05)；当P浓度增至1×10-5 mol/L时, bcl-2蛋白表达率为9.40%，与对照组和P浓度为1×10-6 mol/L时比较，差异均有极显著性（P＜0.01）。结论 P对卵巢癌细胞株HO8910细胞的增殖具有明显抑制作用，呈现剂量-效应关系。P的这种抗癌作用与诱导细胞凋亡有关，抗凋亡基因bcl-2 蛋白表达下降可能是诱发细胞凋亡的机理之一。
The Effect of Progesterone on Proliferation and Apoptosis in Ovarian Cancer Cell
HU Zhuoying, DENG Xiaogu.
（Department of Obstetrics and Gynecology, First University Hospital, Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China）
【Abstract】 Objective To investigate the regulatory effect of progesterone on proliferation and apoptosis in ovarian cancer cell line HO8910 in vitro. Methods Ovarian cancer cell line HO8910 originated from human ovarian serous cystadenocarcinoma was cultured in vitro. Two groups were set up: study group (progesterone in different concentrations) and control group without progesterone. Cell proliferation was measured by 3-(4,5-dimethylthiazol-z-yl)-2,5-dipheny tertrazolium blue (MTT) colorimetric assay. Cell cycle and apoptotic percentage were detected by flow cytometry, morphological changes of apoptotic cells were observed by light and electron microscopy, and apoptotic cells were quantitatively determined by terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling (TUNEL). In addition,expression of intracellular bcl-2 protein was analyzed by flow cytometric indirect immunofluorescent technique.Results Progesterone of 1×10-7～1×10-5mol/L inhibited HO8910 cell growth significantly in a dose-dependent manner （P＜0.01）. After treatment with progesterone, the enhanced G0/G1 arrest was accompanied with the enhanced apoptotic peak and percentage, as well apoptotic cells were found more than those in control group (P＜0.05). By light and electron microscopy, there were many morphological characteristics of apoptosis including compaction and margination of nuclear chromatin, nuclear fragments, and apoptotic bodies. Analysis on expression of intracellular bcl-2 protein showed that progesterone could down-regulate bcl-2 protein and at concentration of 1×10-5mol/L it could almost block bcl-2 expression. Conclusions It is suggested in the present study that progesterone can inhibit the proliferation of epithelial ovarian cancer cells in vitro and there is an accordant dose-response relationship. Its anticancer effect seems to be due to induction of apoptosis which maybe a result of down-regulation of the anti-apoptotic protein bcl-2.
【Key words】 Ovarian neoplasms; Progesterone; Cystadenocarcinoma, serous; Apoptosis; Tumor cells, cultured
细胞凋亡受阻或缺陷是形成肿瘤的机理之一，设法促进细胞凋亡是治疗肿瘤的方向。细胞凋亡和细胞增殖一样，可受到某些生长因子和激素的调节［1］。卵巢癌的激素疗法是否通过诱导细胞凋亡而起作用，目前国内外报道很少。本研究采用多种检测手段，观察孕激素(P)对卵巢癌细胞株HO8910细胞体外增殖及凋亡的影响，以期寻找治疗卵巢癌的有效的辅助措施。
材料与方法
一、材料
卵巢癌细胞株HO8910来源于人卵巢浆液性囊腺癌，由中国科学院上海细胞生物所提供。P和四甲基偶氮唑蓝（MTT）均为美国Sigma公司产品。 细胞凋亡检测试剂盒终末脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法(TUNEL)为德国宝灵曼公司产品。鼠抗人bcl-2 单克隆抗体、异硫氰酸荧光素（FITC）标记羊抗鼠IgG抗体购自北京中山生物技术公司。
二、方法
1.细胞的培养:HO8910细胞培养方法参见文献［2］。
2.细胞增殖的测定：按上述培养方法得到的HO8910单细胞悬液，以每孔6×103个细胞加入96孔培养板中，置于37℃、5％二氧化碳培养箱中培养，第2天待大部分细胞贴壁后4℃培养1 h，以促成细胞同步化生长［2］；换培养液，实验组加入不同浓度的P，每孔20 μl，使其终浓度分别为1×10-8、1×10-7、1×10-6、1×10-5mol/L，每一浓度均设8个平行孔，对照组(下同)加入20 μl空白培养液。继续培养24、48及72 h后，每孔加入20 μl MTT溶液(浓度为5 mg/ml)，轻振培养板，放回培养箱内再孵育4 h后，吸尽上清液，每孔中加二甲亚砜200 μl，振荡器上振荡5～10 min， 用酶标光度计在波长为580nm时测定每孔的吸光度(A)值。 每个实验均重复3次。
3.细胞周期和细胞凋亡率的测定：将浓度为3×104个/ml的HO8910细胞接种于培养瓶中，同步化处理后换培养液，实验组分别加P至终浓度为1×10-7、1×10-6、1×10-5mol/L。继续培养72 h后收集细胞，70％乙醇固定，碘化丙啶染色后置流式细胞仪 (FCM，美国can Becton Dickison公司生产)分析。细胞凋亡率为（凋亡细胞数／总细胞数）×100%，共计数500个细胞。
4.细胞的形态学观察：（1）光学显微镜观察：将浓度为3×104个/ml的H08910细胞悬液接种于24孔培养板中，每孔1 ml， 孔内已预置盖玻片，待细胞生长至对数生长期，换培养液，实验组分别加入浓度为1×10-6、1×10-5mol/L的P，，培养72 h后取出盖玻片，瑞氏染色10～15 min，光学显微镜下观察。（2）细胞超微结构观察：上述方法培养72 h后收集细胞，固定、包埋、切片、染色，采用Hitachi-600透射电子显微镜（日本日立公司生产）观察。
5.细胞凋亡的测定：接种细胞于置盖玻片的24孔培养板，实验组P浓度为1×10-6、1×10-5mol/L，各设8个平行孔。培养72 h后，取出盖玻片，4％多聚甲醛固定，按TUNEL试剂盒说明进行操作，光学显微镜观察凋亡细胞。细胞核呈棕褐色着色者为阳性凋亡细胞，阴性者细胞核呈蓝色。根据阳性凋亡细胞数的多少分为，每低倍镜视野中有阳性凋亡细胞但少于总数1/3者为(+)，1/3～2/3者为(++)，大于2/3者为(+++)，并计算各组凋亡细胞的阳性率。凋亡细胞阳性率为（阳性凋亡细胞孔数／总孔数）×100%。
6.细胞内bcl-2蛋白表达的测定：细胞培养同TUNEL法，收集约1×106个HO8910细胞，多聚甲醛室温固定15 min。加入按1∶50稀释的鼠抗人bcl-2单克隆抗体20 μl，4℃冰浴1 h。每组均设空白对照，即以磷酸盐缓冲液代替一抗。加入异硫氰酸荧光素标记的羊抗鼠IgG抗体 20 μl，4℃暗处孵育30 min。置FCM检测。
三、统计学方法
采用SAS统计软件对计量资料进行方差分析，用Student-Newman-Keuls(SNK)法进行两两比较。计数资料用χ2检验和四格表确切概率法。
结果
一、HO8910细胞的增殖情况
MTT比色法检测P对HO8910细胞的增殖作用，结果见表1。浓度为1×10-8 mol/L时，细胞生长受到轻度抑制,但与对照组比较,差异无显著性（P＞0.05）。当浓度为1×10-7～1×10-5 mol/L时，对细胞生长有明显的抑制效应，与对照组比较，差异均有极显著性(P＜0.01)。在每一时间段，随着浓度的增加，A值呈现明显的下降趋势，显示明显的剂量-效应依赖关系。
二、细胞凋亡率和细胞周期分布情况
表1 两组H08910细胞不同培养时间的A值(
±s)
| 组别 |
时间(h) |
| 24 |
48 |
72 |
| 对照组 |
0.303±0.026 |
0.421±0.082 |
0.598±0.031 |
| 实验组(mol/L) |
| 1×10-8 |
0.302±0.012 |
0.398±0.025△△ |
0.570±0.016△ |
| 1×10-7 |
0.207±0.017* |
0.258±0.037**△△ |
0.343±0.039*△ |
| 1×10-6 |
0.204±0.057* |
0.161±0.028*△△ |
0.165±0.024*△ |
| 1×10-5 |
0.169±0.029* |
0.060±0.133*△△ |
0.075±0.013*△ |
注：与对照组比较，*P＜0.01 **P＜0.05；组内两两比较， △ P＜0.01 △△P＜0.05（下同）
FCM检测HO8910细胞周期分布和细胞凋亡率情况见表2。对照组未发现细胞凋亡，P浓度为1×10-7 mol/L时细胞也无凋亡产生，但与对照组比较，G0/G1期细胞增加，S期细胞减少。随着P浓度的增加可观察到细胞凋亡峰(亚二倍体峰)的出现，并伴随G0/G1期细胞增加而明显增加(P＜0.01)。当P浓度为1×10-6、1×10-5 mol/L时，细胞凋亡率分别为10.38％、35.78％(P＜0.01)，P对HO8910细胞凋亡的诱导也呈剂量依赖趋势。
表2 两组HO8910细胞的细胞周期分布和细胞凋亡率情况
| 组别 |
细胞周期分布(%) |
细胞凋亡率
(%) |
| G0/G1 |
S |
G2/M |
| 对照组 |
61.86 |
25.78 |
12.36 |
．．． |
| 实验组(mol/L) |
| 1×10-7 |
70.33* |
22.16 |
7.51** |
．． |
| 1×10-6 |
72.14* |
16.84** |
11.02 |
10.38 |
| 1×10-5 |
83.45*△ |
10.13* |
6.42* |
35.78△ |
三、形态学变化
1.光学显微镜观察：P作用72 h后的HO8910 细胞，经瑞氏染色，光学显微镜下可见HO8910 细胞呈凋亡细胞形态学改变，表现为细胞核染色质致密固缩，聚集于细胞核核膜呈周边化，细胞核碎裂为大小不一的核片段。见图1。
2.透镜电子显微镜观察：对照组极少见到凋亡细胞和凋亡小体。实验组可见较多凋亡细胞，表现为细胞体积变小，细胞浆密度增大、颜色变深，染色质致密固缩聚集于细胞核核膜呈境界分明的块状或新月形小体，细胞核裂解。P浓度为1×10-5 mol/L时，细胞的凋亡小体较多见，小体内有完整的细胞器。见图2。
四、细胞凋亡情况
TUNEL法检测的细胞凋亡结果见表3,对照组阳性凋亡细胞数很少, 凋亡细胞阳性率为8孔中1孔（1/8），实验组阳性凋亡细胞数明显多于对照组，凋亡细胞阳性表达随剂量增加而增多，其中以P浓度为1×10-5 mol/L时作用最为明显，8孔中7孔（7/8）为凋亡细胞阳性，明显高于对照组(P＜0.05)。
表3 两组HO8910细胞的凋亡情况(孔数)
| 组别 |
平行孔 |
阳性凋亡细胞 |
阳性孔 |
| (-) |
(+) |
(++) |
(+++) |
| 对照组 |
8 |
7 |
1 |
0 |
0 |
1 |
| 实验组(mol/L) |
|
| 1×10-6 |
8 |
4 |
1 |
2 |
1 |
4 |
| 1×10-5 |
8 |
1 |
0 |
2 |
5 |
7 |
五、bcl-2蛋白表达情况
bcl-2蛋白表达采用FCM检测，对照组bcl-2蛋白表达率为71.07％，P浓度为1×10-6 mol/L时，bcl-2蛋白表达率下降至61.25％，与对照组比较，差异有显著性（P＜0.05)。当P浓度增至1×10-5 mol/L时，bcl-2蛋白表达率明显降低，为9.40％，几乎阻断了bcl-2蛋白的表达，明显低于对照组以及P浓度为1×10-6 mol/L时(P＜0.01)。
讨论
一、P抑制HO8910细胞生长的作用及其机理
有报道认为，P使子宫内膜癌细胞分化趋向成熟，已癌变的子宫内膜沿分泌相变化，有丝分裂数明显减少，阻遏其进一步增生恶变［1,3］，提示P对癌细胞有直接抑制作用。Langdon等［4］研究发现，甲地孕酮能抑制P受体阳性的PE04卵巢癌细胞株移植物生长，但对P受体阴性的HOX60移植物无作用。P抗癌作用的机理尚不十分清楚，目前认为，可能是通过P进入细胞核，直接在细胞核内与受体结合，激活的受体作为转录调节蛋白与称之为激素反应成份(HRE)特异的核DNA片段结合，进而转录合成mRNA，进入细胞浆合成各种特异性蛋白质，从而使卵巢癌细胞生长受到抑制。已证实，HO8910细胞含有雌激素受体和P受体，提示可能为性激素依赖细胞［5］。临床上，通常运用比黄体期P的生理浓度（约50 nmol/L）高10～100倍的P剂量来治疗卵巢癌［6］。本研究采用与临床治疗量血中浓度相近的P浓度,通过体外实验证实，P能够明显抑制卵巢癌细胞株HO8910细胞的生长，其抗增殖效应呈现剂量依赖性。由此可见,P抑制HO8910细胞的生长可能通过P受体发挥作用。
二、P诱导HO8910细胞凋亡的作用及其机理
目前，关于P诱导卵巢癌细胞凋亡的报道很少。Formby等［7］研究证实，P能够诱导P受体表达阳性的T47-D乳腺癌细胞凋亡从而抑制其生长。国内有学者发现，P治疗后的子宫内膜癌组织中观察到发生凋亡的腺癌细胞［3］。本研究采用FCM、TUNEL 法及形态学观察等多种细胞凋亡检测手段，观察了P在诱导HO8910细胞凋亡方面的作用，以初步探讨其抗癌机理。结果发现，P能够诱导HO8910细胞发生凋亡，且随P剂量升高，细胞凋亡作用增强。HO8910细胞瑞氏染色后光学显微镜下可见细胞凋亡的早期改变；透射电子显微镜下可发现大量凋亡小体。同时还观察到，P改变了细胞周期时相的分布，使G0/G1期细胞增多。利用TUNEL法对凋亡细胞进行定性和半定量测定发现，P作用后出现大量凋亡细胞，实验组凋亡细胞阳性率高于对照组。本实验在对照组中用TUNEL法测出凋亡细胞阳性率为8孔中1孔（1/8）,而用FCM未测出细胞凋亡,这可能是因为FCM测定的是出现在G0/G1期的细胞凋亡,不能发现S期的细胞凋亡。
细胞凋亡受到基因的调控。bcl-2是一主要的抗凋亡基因， 其编码产物bcl-2蛋白具有促进细胞存活，对抗细胞凋亡的作用。bcl-2蛋白可在多种组织中表达，尤以肿瘤组织中表达较强，广泛位于线粒体膜、内质网膜等细胞器膜上。Saegusa等［8,9］报道，bcl-2蛋白表达同子宫内膜癌的低凋亡指数密切相关，而P能调节bcl-2蛋白表达。Formby等［10］对乳腺癌细胞的体外实验观察到，P浓度为10 μmol/L时作用72 h后，48%的乳腺癌细胞发生凋亡，同时bcl-2 mRNA和蛋白表达率显著下降。Bu等［6］研究发现，P能诱导卵巢癌细胞株AO和3AO发生细胞凋亡，但不引起bcl-2蛋白表达的改变。本实验对bcl-2蛋白定量测定发现，P能明显降低卵巢癌细胞株HO8910的bcl-2蛋白表达率， 这可能是由于所选卵巢癌细胞株组织学类型不同的缘故。bcl-2蛋白的下降可能是P诱发HO8910细胞凋亡的机理之一，P能够解除bcl-2基因对抗细胞凋亡的作用。
图1 光学显微镜所见（孕激素浓度为1×10-5 mol/L，培养72h）：箭头所示细胞膜皱缩，细胞核裂解成大小不一的核片段。瑞氏染色×400图2 透射电子显微镜所见（孕激素浓度为1×10-5 mol/L，培养72h）：箭头所示大量凋亡小体形成，其内可见致密染色质和完整细胞器。透射电子显微镜×8000
参考文献
1，Saegusa M, Okayasu I. Progesterone therapy for endometrial carcinoma reduces cell proliferation but does not alter apoptosis. Cancer, 1998, 83:111-121.
2，鄂征，主编. 组织培养和分子细胞学技术.第1版. 北京: 北京出版社,1994. 78-85.
3，陈晨，华祖德，金晓龙，等.孕激素治疗子宫内膜癌的形态学观察与治疗机理探讨.中华妇产科杂志，1997，32:415-417.
4，Langdon SP, Gabra H, Bartlett JM, et al. Functionality of the progesterone receptor in ovarian cancer and its regulation by estrogen. Clin Cancer Res,1998,4:2245-2251.
5，牟舟，许沈华，张弈荫，等.人卵巢癌细胞系HO8910的建立及其生物学特性.中华妇产科杂志,1994,29:162-164.
6，Bu SZ, Yin DL, Ren XH, et al. Progesterone induces apoptosis and up- regulation of p53 expression in human ovarian carcinoma cell lines. Cancer, 1997,79:1944-1950.
7，Formby B, Wiley TS. Progesterone inhibits growth and induces apoptosis in breast cancer cells: inverse effects on bcl-2 and p53. Ann Clin Lab Sci,1998,28:360-369.
8，Saegusa M, Kamata Y, Isono M, et al. Bcl-2 expression is correlated with a low apoptotic index and associated with progesterone receptor immunoreactivity in endometrial carcinomas. J Pathol,1996,180:275-282.
9，Saegusa M,Okayasu I. Down-regulation of bcl-2 expression is closely related to squamous differentiation and progesterone therapy in endometrial carcinomas. J Pathol,1997,182:429-436.
10，Formby B, Wiley TS. Bcl-2, survivin and variant CD44 v7-v10 are downregulated and p53 is upregulated in breast cancer cells by progesterone:inhibition of cell growth and induction of apoptosis. Mol Cell Biochem,1999,202:53-61.
(收稿日期：1999-11-30)
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