白细胞介素2基因转导对卵巢癌细胞系SKOV3免疫原性的影响

中华妇产科杂志 2000年第7期第35卷 论著

作者：张震宇　 郎景和

单位：张震宇（100700 北京军区总医院妇产科）；郎景和（中国医学科学院中国协和医科大学北京协和医院妇产科）

　　关键词： 卵巢肿瘤；白细胞介素2；基因转移；癌症疫苗；肿瘤细胞，培养的

　　【摘要】　目的　探讨白细胞介素2 (IL-2)基因转导对卵巢癌细胞系SKOV3免疫原性的影响。方法　应用流式细胞术，测定SKOV3细胞组织相容性白细胞抗原(HLA)HLA-ABC、HLA-DQ及HLA-DR分子的表达，⁵¹Cr-4h释放实验显示SKOV3、SKOV3/Neo、SKOV3/IL-2细胞对自然杀伤(NK)细胞和淋巴因子激活杀伤(LAK)细胞杀伤的敏感性。结果　SKOV3/IL-2细胞中HLA-ABC、 HLA-DQ 及HLA-DR分子的表达率(17.7%、19.1%及9.4%)较SKOV3(1.5%、2.4%及4.7%)和SKOV3/Neo(4.3%、6.9%及2.1%)显著提高；SKOV3、SKOV3/Neo和SKOV3/IL-2细胞对NK细胞的杀伤均不敏感，但SKOV3/IL-2细胞对LAK细胞的杀伤敏感性较SKOV3、SKOV3/Neo细胞提高约1倍，差异有非常显著性；肿瘤细胞与淋巴细胞混合培养显示，淋巴细胞有向SKOV3/IL-2细胞聚集的趋势。结论　IL-2基因转导可提高卵巢癌细胞系SKOV3的免疫原性。

Effects of Human Interleukin-2 Gene Transfer on the Immunity of Ovarian Cancer Cell Line SKOV3

ZHANG Zhenyu, LANG Jinghe.

　　（Deptment of Obstetrics and Gynecology, General Hospital of Beijing Military Command, Beijing 100700, China）

　　【Abstract】　Objective　To study the effect of interleukin-2 (IL-2) gene transfer on the immunity of ovarian cancer cell line SKOV3. 　Methods　The expression of main histologic complex (MHC) molecular HLA-ABC, HLA-DR and HLA-DQ of SKOV3, SKOV3/Neo and SKOV3/IL-2 cells were detected by flow cytometry. The ⁵¹　Cr-4hr releasing test was employed to detect the killing effects of natural killer (NK) and lymphokine-activated killer (LAK) cells. Meanwhile, the tumor cell and lymphocyte co-culture was performed.Results　The expression of HLA-ABC, HLA-DR and HLA-DQ molecular of hIL-2 gene modified cells was upregulated markedly. The　⁵¹Cr-4hr releasing test showed that the parental and gene modified cells were markedly resistant to NK cells, but the IL-2 gene modified cells was more sensitive to LAK cells. There were significant differences between them (P＜0.01). The “cross-talk” of tumor cell with lymphocyte was observed when the hIL-2 gene modified SKOV3 cells were cocultured with lymphocyte.Conclusion　IL-2 gene transfer can enhance the immunity of ovarian cancer cell line SKOV3.

　　【Key words】　Ovarian neoplasms; Interleukin-2; Gene transfer; Cancer vaccines; Tumor cells, cultured

　　肿瘤免疫属T淋巴细胞免疫^［1］，由于肿瘤相关抗原的抗原性弱、肿瘤细胞组织相容性白细胞抗原(HLA)及共刺激信号B₇低表达或不表达，致使肿瘤抗原不能有效递呈，最终导致机体对肿瘤细胞的免疫耐受^［2,3］。基因重组技术的不断完善，由分子水平修饰肿瘤细胞的设想成为现实^［4］。本研究旨在探讨白细胞介素2 (IL-2）基因转导对卵巢癌细胞免疫原性的影响，及IL-2基因修饰卵巢癌细胞作为肿瘤疫苗的可能性。

　　材料与方法

　　一、细胞系

　　SKOV3为卵巢腺癌细胞系，由北京协和医院妇产科制备。SKOV3/Neo由逆转录病毒介导，将新霉素抗性基因Neo导入SKOV3细胞而建立，具有新霉素抗性^［5］。SKOV3/IL-2由逆转录病毒介导，将IL-2基因导入SKOV3细胞而建立，IL-2每24 h分泌量为318 U/10⁶个细胞，具有新霉素抗性^［5］。

　　二、方法

　　1.细胞HLA分子检测：待测肿瘤细胞共1×10⁶个，分别与鼠抗人HLA-ABC、HLA-DR及HLA-DQ单克隆抗体(购于中国华美公司)稀释液混合、孵育、洗涤，用荧光标记的兔抗鼠IgG标记，2％多聚甲醛固定过夜，第2天应用流式细胞仪检测表达上述3种免疫分子的细胞比例。

　　2.自然杀伤（NK）细胞的制备：外周血单个核细胞经密度梯度离心法分离后，置于培养瓶中常规培养1 h，去除贴壁的单核细胞，未贴壁细胞用于NK细胞杀伤实验。

　　3.淋巴细胞与肿瘤细胞混合培养：培养体系为含10％新出生牛血清和5×10^-5 mol/L二巯基乙醇的PRIM-1640培养液。取正常成人外周血淋巴细胞，调整细胞浓度为2×10⁶个/ml；待测肿瘤细胞经⁶⁰Co 50 Gy照射，调整细胞浓度为5×10⁴个/ml；取96孔培养板，每孔加入淋巴细胞悬液、肿瘤细胞悬液各100 μ1，孵育36～48 h，显微镜下观察淋巴细胞生长情况。

　　4.淋巴因子激活杀伤（LAK）细胞的诱导：培养体系为含10％人AB血清、1 000 μ/ml重组人IL-2（r-h-IL-2）、5×10^-5 mol/L 二巯基乙醇、2% 血清白蛋白及5 μ/ml植物血凝素的PRIM-1640培养液。将正常成人外周血淋巴细胞，加入上述培养体系，常规培养5～7 d。

　　5.淋巴细胞杀伤活性的测定：以SKOV3、SKOV3/Neo和SKOV3/IL-2为靶细胞，应用⁵¹Cr对其进行标记；分别以NK和LAK细胞为效应细胞，设3个效靶比，分别为100∶1、50∶1和10∶1，将效应细胞与靶细胞混合(实验组)，同时设加PRMI-1640培养液者为自然释放组，设加6 mol/L盐酸者为最大释放组，γ计数仪测定各孔上清液放射性强度（cpm）。自然释放率和杀伤活性的计算公式如下：

　　结果

　　一、SKOV3及其基因修饰细胞HLA分子的表达

　　SKOV3、SKOV3/Neo和SKOV3/IL-2 3类细胞HLA-ABC、HLA-DR和HLA-DQ分子的表达率见表1。与SKOV3和SKOV3/Neo比较，SKOV3/IL-2细胞HLA-ABC和HLA-DQ分子的表达率均有提高，差异有非常显著性（P＜0.001）。

　　二、SKOV3及其基因修饰细胞对NK细胞杀伤的敏感性

　　3种靶细胞对NK细胞的杀伤作用均不敏感，差异无显著性（P＞0.05），见表2。

表1　SKOV3及其基因修饰细胞HLA分子的表达率(%)

表2　3种靶细胞对不同效靶比NK细胞杀伤的敏感性(%)

　　三、SKOV3及其基因修饰细胞对LAK细胞杀伤的敏感性

　　LAK对3种靶细胞均有不同程度的杀伤效应，SKOV3/IL-2细胞对LAK杀伤的敏感性最高，3个效靶比的杀伤敏感性均分别为SKOV3、SKOV3/Neo的2倍，差别有非常显著性（P＜0.001），见表3。

表3　3种靶细胞对不同效靶比LNK细胞杀伤的敏感性(%)

　　四、肿瘤细胞和淋巴细胞混合培养情况

　　淋巴细胞与肿瘤细胞共培养36～48 h后，含SKOV3/IL-2细胞的培养孔内，淋巴细胞以肿瘤细胞为中心聚集成簇，可见淋巴细胞围绕于肿瘤细胞周围，呈花瓣状；含SKOV3、SKOV3/Neo细胞的培养孔内淋巴细胞均匀分布于培养皿底部，呈沙粒状，未见淋巴细胞将肿瘤细胞包绕的现象。

　　讨论

　　细胞免疫原性的高低，在一定程度上取决于细胞免疫分子表达的强弱。目前，已知的免疫分子主要有HLA、B₇及肿瘤相关抗原（TAA）等^{［1, 6, 7］}。TAA是一种相对分子质量极小的肽，必须与肿瘤细胞或多形核白细胞膜表面的HLA（又称为主要组织相容复合物，MHC）分子结合，才能被T淋巴细胞表面受体(TCR)识别，继而T淋巴细胞被激活、扩增，发挥免疫效应，这种识别受T淋巴细胞膜表面HLA分子的限制。可见免疫分子在肿瘤免疫调控中具有极为重要的意义，肿瘤细胞MHC分子多为低表达甚至不表达，是肿瘤免疫耐受的主要原因之一^［4］。

　　本研究显示，IL-2基因转导可增强卵巢癌细胞系SKOV3的免疫原性，主要表现在以下两个方面：(1) 在淋巴细胞与肿瘤细胞混合培养过程中，可见淋巴细胞向SKOV3/IL-2细胞聚集、包绕；裸鼠皮下成瘤实验中，在SKOV3/IL-2组肿瘤包膜周围，可见大量单个核细胞渗出，向肿瘤组织浸润^［8］，说明IL-2基因修饰肿瘤细胞与淋巴细胞间有cross-tal(“通讯”)^［9］现象存在。(2) IL-2基因修饰细胞对LAK细胞的敏感性较亲本细胞明显增强。IL-2基因转导细胞的免疫原性增强，可能与以下因素有关：（1）IL-2基因转导使肿瘤细胞膜表面MHC分子表达上调、抗原性增强，有利于肿瘤抗原的递呈、识别，激发抗肿瘤免疫，对打破肿瘤免疫耐受具有极其重要的意义；(2) SKOV3/IL-2细胞可分泌IL-2，IL-2是淋巴细胞活化和维持增殖的重要因子^［10］，SKOV3/IL-2细胞所分泌的IL-2，改变了肿瘤细胞局部的微环境，利于淋巴细胞的生存，因此，可对淋巴细胞产生一种类似趋化的作用。Fearon等^［11］证实，IL-2基因修饰的肿瘤细胞的抗原递呈能力增强，不需辅助性T细胞参予即可激活T淋巴细胞。可见，通过转基因技术，改善肿瘤细胞免疫相关分子的表达，可打破肿瘤免疫耐受状况。

　　对卵巢癌以外的其他诸多肿瘤基因转导动物模型的研究证实, IL-2基因转导可提高肿瘤细胞MHC的表达，改善肿瘤细胞局部的免疫微环境，激活CD8⁺T淋巴细胞，产生针对野生型肿瘤细胞的抗肿瘤免疫反应，可作为肿瘤疫苗，治疗已荷肿瘤，抵御肿瘤再次侵袭^［12,13］。IL-2基因转导使人卵巢癌细胞免疫原性增强，提示IL-2基因修饰卵巢癌细胞有望成为肿瘤疫苗，用于卵巢癌的预防与治疗。

参考文献

　　1，Baxevanis CN, Papamihail M. Characterization of the anti-tumor immune response in human cancers and strategies for immunotherapy. Crit Rev Oncol Hematol, 1994, 16:157-179.

　　2，Mondino A, Khoruts A, Jenkins MK. The anatomy of T-cell activation and tolerance. Proc Natl Acad Sci USA， 1996， 93: 2245-2252.

　　3，Browning MJ, Bodmer WF. MHC antigen and cancer: implications for T-cell surveillance. Curr Opinion Immunol, 1992, 4: 613-618.

　　4，Bruyns C, Gerard C, Velu T. Cancer escape from immune surveillance: how can it be overcome by gene transfer Eur J Cancer, 1994, 30: 1176-1181.

　　5，张震宇，郎景和. 白细胞介素2基因转导对卵巢癌细胞SKOV3形态及增殖的影响. 中华妇产科杂志，1998，33: 614-617.

　　6，Germain RN. MHC-dependent antigen processing and peptide presentation: providing ligands for T lymphocyte activation. Cell, 1994, 76: 287-299.

　　7，Boussiotis VA, Treeman GJ, Gribben JG, et al. Activated human B lymphocytes express three CTLA-4 counterreceptors that costimulate T-cell activation. Proc Nat Acad Sci USA, 1993, 90:11059-11063,11112.

　　8，张震宇，郎景和. 白细胞介素2基因转导对卵巢癌细胞系SKOV3致瘤性的影响. 妇产科新进展，1998, 7:122-126.

　　9，Colombo MP, Modesti A, Parmiana G. Local cytokine availability elicits tumor rejection and systemic immunity through granulocyte-T-lymphocyte cross-talk. Cancer Res, 1992, 52: 4853-4857.

　　10，周廷冲, 主编. 多肽生长因子基础与临床. 北京：中国科技出版社，1992. 268-279.

　　11，Fearon ER, Pardoll DM, Itaya T, et al. Interleukin-2 production by tumor cells bypasses T helper function in the generation of an antitumor response. Cell， 1990, 60: 397-403.

　　12，Gansbacher BB, Zier K, Daniels B, et al. Interleukin 2 gene transfer into tumor cells abrogates tumorigenicity and induces protective immunity. J Exp Med 1990, 172: 1217-1224.

　　13，Dalgleish D. The role of IL-2 in gene therapy. Gene Therapy, 1994, 1: 83-87.

(收稿日期：1999-07-22)