应用定量逆转录聚合酶链反应技术检测子宫颈癌多药耐药基因的表达

中华妇产科杂志 1998年第3期第0卷 论著摘要

作者：康山　李琰　宋藏珠　孙玉敏　宋俊芬　周卫东

单位：050011 石家庄，河北医科大学附属第四医院妇产科(康山，宋臧珠，宋俊芬)；河北省肿瘤研究所(李琰，孙玉敏)；北京师范大学生物系(周卫东)

　　多药耐药是提高肿瘤化疗疗效的主要障碍之一，对其研究的一个重要任务就是找出切实可行的检测方法。以前的研究表明，多药耐药基因(MDR₁)编码的跨膜糖蛋白Pgp介导细胞内药物外流^［1］，可能是肿瘤细胞存在的一种耐药机制。因此，对其检测有一定的临床意义。我们用逆转录聚合酶链反应技术(RT-PCR)对50例宫颈癌手术及活组织检查标本进行了检测，现将结果报道如下。

　　一、材料与方法

　　1.研究对象：全部组织标本取自1994年3月至1996年3月在我院住院的50例宫颈癌患者并经组织病理学检查确诊。详细分为：初诊患者32例；复发癌18例，其中13例于复发前行CFP方案(环磷酰胺，5-氟尿嘧啶，顺铂)联合化疗，5例行放疗。全部病例中鳞癌38例，腺癌12例。高分化癌23例，低分化癌27例。临床分期按FIGO标准，Ⅰ～Ⅱ期28例，Ⅲ～Ⅳ期22例(其中18例为复发者)。取得标本后迅速放入-70℃冰箱中冷冻待检。

　　2.检测方法：用本室自行建立的抗三尖杉酯碱 HL-60/HT细胞亚系作为阳性对照，采用人类早幼粒细胞白血病HL-60细胞系作为阴性对照。RNA提取按异硫氰酸法；cDNA采用随机引物从总RNA中合成；MDR₁引物按照参考文献［2］；RT-PCR反应后取扩增产物进行琼脂糖电泳并拍照。通过密度梯度扫描，用MDR₁与β₂-微球蛋白(β₂-M)扩增带的灰度比值表示细胞MDR₁表达水平，记录结果。

　　3.统计学方法：全部结果采用t检验进行统计学分析。

　　二、结果

　　1.在小于30次循环的情况下MDR₁与β₂-M呈线性关系，其比值稳定，因此我们选定25次为本实验PCR循环数。在此前提下，RNA用量为50～100 ng时，MDR₁/β₂-M比值波动小，比较真实地反映HL-60/HT细胞中MDR₁/β₂-M比值，因此实际测定时每个标本均取100 ng RNA。

　　2.在50例宫颈癌患者的组织标本中，31例MDR₁表达阳性，占62%。见附表。其中原发患者18例阳性，复发患者13例阳性，MDR₁表达水平分别为0.213±0.025及0.363±0.276，后者较前者显著增高(P＜0.05)；高分化患者13例阳性，低分化患者18例阳性，MDR₁表达水平分别为0.129±0.056及0.265±0.072，后者有显著增高趋势(P=0.08)。不同病理类型及分期的MDR₁表达水平差异无显著性(P＞0.5)。

　　在13例MDR₁表达阳性的复发患者中，10例在复发前应用化疗，3例应用放疗，其MDR₁表达水平分别0.375±0.313及0.323±0.119，差异无显著性(P＞0.5)。

　　三、讨论

　　大量研究表明肿瘤患者的MDR₁ mRNA的表达与Pgp的表达及肿瘤细胞的交叉耐药性存在良好的相关性^［3］。正常宫颈组织中无MDR₁表达^［4］，本组50例宫颈癌患者中31例MDR₁表达阳性，占62%。18例复发癌患者中13例MDR₁表达阳性，其中10例在复发前应用CFP联合化疗达到临床治愈，且MDR₁表达量较原发患者显著增高(P＜0.05)，提示化疗可诱导肿瘤细胞MDR₁的过度表达从而产生耐药。另有3例MDR₁表达阳性者在复发前应用放疗达到临床治愈，其MDR₁表达量与应用化疗复发者MDR₁表达量的差异无显著性(P＞0.5)，虽然放疗与MDR₁表达无明显关系，但可提示在宫颈癌的恶变过程中可能存在MDR₁基因的激活和过度表达从而导致耐药。但无论是何种原因导致的MDR₁的过度表达均与预后不良存在一定的关系。

　　我们认为，检测MDR₁表达可为制定化疗方案提供依据，对选用MDR₁非相关药物组成化疗方案、提高化疗效果、防止复发具有一定的价值。

附表　MDR₁表达与不同临床及病理因素的相关性

参考文献

　　1　周卫东，张鸿卿，方敏.抗维拉帕米的多药抗性细胞系HL-60/VRP.Chinese Sceince Bulletin, 1995, 22:2091-2095.

　　2　Xu D, Knaust E, Pis P, et al. Levels of MDR₁ and mRNA in leukaemic cell population from patients with acute myelocytis leukaemic are heterogeneous and inversely correlated to cellular daunorubicin accumulation. Br J Haematol, 1996, 92:847-854.

　　3　Webb M, Raphael CL, Asoahr H, et al. The detection of rhodamine 123 efflux at low levels of drug resistance. Br J Haematol, 1996, 91:650-655.

　　4　Cordon-cardo C, O'brine JP, Boccia J, et al. Expression of the multidrug resistance gene product (P-glycoprotein) in human normal and tumor tissues. J Histochem Cytochem, 1990, 38:1277-1287.

(收稿：1997-07-04　　修回：1997-12-08)