改良流感嗜血杆菌培养基的实验研究与评价

中华医学检验杂志 1998年第3期第21卷 论著

作者：修清玉　方正　赖国祥　王桂芳　罗文侗　陈吉泉

单位：200003 上海，第二军医大学长征医院呼吸内科

　　关键词： 嗜血杆菌属；培养基；呼吸道感染

　　【摘要】　目的　评价自制改良哥伦比亚巧克力培养基(ICCA)对流感嗜血杆菌(Hin)的分离培养效果。方法　将Hin ATCC 42947接种于ICCA和其他4种培养基上，计算和比较5种培养基Hin的平均生长指数；用ICCA对448份痰标本进行检测，比较其与血琼脂加金葡菌划线(BASS)方法的Hin检出率。结果　与其他4种培养基比较，ICCA的Hin平均生长指数为17.79，痰标本中的Hin的检出率为20.1%，ICCA明显高于BASS(检出率12%)，经χ²检验P＜0.01。结论　ICCA是一种较好的Hin选择性培养基，值得推广应用。

　　Laboratory and clinical evaluations of an improved medium for isolation of Haemophilus influenzae 　Xiu Qingyu, Fang Zheng, Lai Guoxinag, et al. Department of Respiratory Medicine, Changzheng Hospital, The Second Military Medical Unviersity, Shanghai 200003

　　【Abstract】　Objective　To evaluate isolating efficacy of an improved chocolated Columbia Agar (ICCA) for Haemophilus influenzae.Methods　We evaluated ICCA with other four selective media for the ability of the growth of Hin (ATCC49247) by using a growth index (GI) that combines colony sites and the dilution factor, and we also used this ICCA medium to isolate Hin from 448 specimens from the respiratory tract, and compared this medium with blood agar with S.aureus streak.Results　GI of Hin on ICCA was 17.8, which was higher than that of the other 4 media. The isolating rate of Hin of the 448 respiratory tract specimens on ICCA was 20.1% (90/448), which was significantly higher than that on the medium BASS.Conclusion　ICCA is a better selective medium for isolation of Hin. It is valuable to use this medium in laboratories to improve the detective rate of Hin.

　　【Key words】　Haemophilus influenzae　　Media　　Respiratory tract infections

　　流感嗜血杆菌(haemophilus influenzae, Hin)是引起急性下呼吸道感染最常见的致病菌之一，因此，Hin的分离培养对临床上早期诊断和指导治疗极为重要。但Hin的生长需Ⅴ因子和Ⅹ因子等条件，常规培养阳性率低，为了提高Hin的检出率，我们根据国内外经验，研制了改良哥伦比亚巧克力琼脂培养基，在与文献推荐的4种Hin培养基进行比较的基础上，临床应用获得较好效果。报道如下。

材料和方法

　　一、材料

　　1.培养基：(1)改良哥伦比亚巧克力琼脂(improved columbia chocolated agar, ICCA)以columbia琼脂为基础，加2%胰蛋白胨，0.1%淀粉，1%酵母浸膏，溶于1 000 ml蒸馏水中，调整pH值至7.4～7.6，高压灭菌3分钟冷却至85℃加入5%脱纤维羊血制成平板。(2)血琼脂(blood agar, BA) 按常规方法制备。(3)普通巧克力琼脂(common chocolate agar, C Choc) 按常规方法^［1］配制。(4)改良GCYSB培养基(M GCYSB) 按Rennie等^［2］及邓光贵等^［3］的方法配制。(5)mueller-hinton琼脂(MHA) 以M-H琼脂(上海试剂供应中心产品)为基础，加入0.5mg/ml血红素及β-NAD(Sigma公司产品)^［4］。β-NAD经滤过器过虑后加入高压灭菌冷却至50℃的MHA中，倾注平板。(6)脑心浸液琼脂培养基(brain heart infusion agar, BHIA) 按吴丽华等^［5］的配方配制。

　　2.菌种及标本来源：(1)菌种：Hin ATCC49247由疾病控制中心引进，美国Lilly公司赠送。(2)临床标本：收集1994年9月～1996年3月我院门、急诊拟诊为急性下呼吸道感染的初诊448例患者标本，冷开水漱口留取痰标本，镜检示多形核白细胞和鳞状上皮细胞之比＞2.5∶1者视为合格标本，1小时之内接种培养基。

　　二、方法

　　1.生长指数(GI)测定：将Hin ATCC49247菌种复苏。参考Anstey法^［6］挑取菌落置生理盐水中制成相当于0.5麦氏比浊管浓度的悬液，连续稀释至第8管，取0.1 ml，分别接种于上述5种培养基上，每种培养基接种3块平板，用L形棒均匀涂布菌液，置5%CO₂ ，37℃，孵育24小时，在40倍显微镜下准确量取菌落直径。GI等于平皿上生长菌落数少于10个的最高稀释倍的对数，乘以该平皿上菌落平均直径。如10^-4 稀释时平皿上生长6个菌落，其平均直径为2.5 mm，则GI=4×2.5=10。计算每一种培养基的Hin平均GI。

　　2.痰标本Hin分离：取合格痰标本中心部分划线接种于ICCA及BA两种培养基上，ICCA的第2区以倒三角形贴上万古霉素(V 30 μg)，杆菌肽(B 10IU)及氯洁霉素(CM 2 μg)3种药敏纸片(上海卫生防疫站供应)，间距1.5～2 cm，简称ICCA-VBA；BA平板上划线接种痰标本后，做1→3区及2→4区的金黄色葡萄球菌交叉划线接种(BASS)，置5%CO₂ ，37℃孵育24小时观察，挑取可疑菌落做鉴定。

　　3.Hin鉴定依据：(1)菌落呈无色透明或灰白色、半透明、湿润、圆形隆起，且具特殊反光现象，直径约0.3～0.7 mm；(2)菌形呈多形的革兰阴性球杆菌；(3)生长需要Ⅴ因子和Ⅹ因子卫星试验)；(4)在血琼脂平皿上不溶血。

　　4.统计学分析：ICCA-VBC和BASS两种培养基Hin分离率用χ²检验，比较ICCA与其他4种培养基的GI差异用t检验。

结果

　　1.Hin在5种培养基上生长指数(GI)见表1。所有培养基在10^-6倍稀释时均有Hin生长，但在10^-7 倍稀释时，仅见ICCA及M GCYSB有两块平皿，MHA有一块平皿上有Hin菌落生长。表1结果显示，ICCA培养基上菌落最大且典型，平均直径为2.67 mm，M GCYSB、C Choc及MHA培养基上Hin菌落相对较小，虽在10^-6BHIA培养基上生长但菌落最小，平均直径小于1.00 mm。经统计学处理，ICCA的GI值最高，与其他4种培养基GI比较差异有显著性(P＜0.01)。

　　2.ICCA、BASS两种培养基对痰标本Hin分离培养结果见表2。ICCA培养基上检出90株Hin，Hin阳性率为20.1%(90/448)。生长在该培养基2区形成的三角形局部Hin分离培养区内，其他细菌少或无，经χ²检验，ICCA培养基对Hin的阳性检出率明显高于BASS培养基(P＜0.01)。

表1　Hin ATCC49247在5种培养基上GI检测结果

表2　两种培养基对Hin分离结果比较(例数)

　　经χ²检验P＜0.01

讨论

　　一般认为，Hin在有Ⅹ、Ⅴ因子的培养条件下易于生长，或者采用“卫星试验”血琼脂加金葡菌划线法分离及鉴定Hin^［7］ 。由于杂菌生长等因素影响Hin分离率，因此即使在某些营养培养基中加入Ⅹ因子、Ⅴ因子，Hin的生长亦非最好。Rennie等^［2］新近对GC琼脂、普通巧克力琼脂、Columbia琼脂、Brucella琼脂、脑心浸液琼脂(BHIA)、Muller-Hinton琼脂6种培养基培养Hin，做进一步的组方配伍分析，认为GC琼脂加1%酵母浸膏及5%脱纤维羊血加热巧克力化(GCYSB)的培养基，GI值最高。Columbia巧克力琼脂上的GI仅次于GCYSB，BHIA及MHA虽添加血红素和β-NAD，GI值低(表1)。我们的实验结果显示，ICCA上Hin菌落最大(平均直径2.67 mm)，GI值最高(17.79±1.47)，明显高于其他4种培养基，BHIA的GI值最低(4.26±0.48)。5种培养基在较高稀释度时均观察到Hin生长，其中ICCA，M GCYSB及MHA 3种培养基在菌液稀释达10^-7时仍见Hin生长，因此认为ICCA，M GCYSB是较好的Hin生长培养基，尽管MHA培养基上Hin菌落生长不理想(平均直径1.57 mm)，仍不失作为美国NCCLS推荐的Hin试验专用培养基^［4］。通过临床448个病例应用结果显示，在急性下呼吸道感染的初诊患者中，ICCA的分离率高(表2)，同国外报道相似^［8～10］。因此，我们认为，ICCA是一种价格适宜，配制方便，临床应用价值高的Hin选择性培养基，有望在基层实验室普及采用。

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(收稿：1997-07-07　　修回：1998-01-16)