阵发性睡眠性血红蛋白尿症淋巴细胞亚群数量异常与GPI蛋白缺失的研究

中华血液学杂志 2000年第10期第21卷 论著

作者：张君丽　沈志坚　吴建波　江松福

单位：325003　温州医学院附属第一医院

关键词：血红蛋白尿，阵发性；淋巴细胞；抗原，CD_{55<；sub>；抗原，CD59<；sub>}

　　【摘要】　目的　分析阵发性睡眠性血红蛋白尿症（PNH）患者外周血淋巴细胞亚群数量及T、B淋巴细胞和NK细胞表面糖基磷脂酰肌醇（GPI)蛋白表达情况，以期能深入探讨PNH的本质。方法　PNH患者共15例，采用双色和三色荧光标记的单克隆抗体，在流式细胞仪上分析淋巴细胞亚群分类计数和测定T、B淋巴细胞和NK细胞表面CD₄₈、CD₅₅、CD₅₉抗原。结果　15例患者均有不同程度的淋巴细胞亚群数量异常，以B淋巴细胞和NK细胞的数量减少为明显（分别占80.0%和93.3%）。PNH患者T、B淋巴细胞和NK细胞表面均有不同程度的GPI蛋白缺失，NK细胞GPI蛋白缺失百分比最高（78.7%），B淋巴细胞次之（53.4%），T淋巴细胞最少（30.5%），三者之间差异有显著性（P＜0.01）。在2例已达持续缓解的患者中无红细胞GPI蛋白缺失，但均有T、B淋巴细胞GPI蛋白缺失。其中1例缓解已达3年的患者有NK细胞GPI蛋白缺失，但缺失率较低（15.8%）。结论　 淋巴细胞也存在GPI蛋白缺失现象，T、B淋巴细胞以GPI蛋白缺失能持续较长时期，而NK细胞却以GPI蛋白缺失发生率高（93.3%）、缺陷细胞数量多（78.7%）为特征。

Lymphocyte subsets analysis and glycosylphosphatidylinositol determination in patients with PNH

ZHANG Junli　SHEN Zhijian　WU Jianbo

　　（First Affiliated Hospital, Wenzhou Medical College， Wenzhou　325003, China）

　　【Abstract】　Objective　Absolute number of lymphocyte subsets and the proportion of glycosylphosphatidylinositol (GPI)-deficient clones among T, B and NK cells were determined. Methods　 By using multicolor flow cytometry with two and three color labelled monoclonal antibodies, absolute number of lymphocyte subsets and the proportion of CD₄₈, CD₅₅, CD₅₉-deficient T, B and NK cells were analyzed. Results　Lymphocyte subsets were found abnormal in all patients, low absolute number of natural killer cells and B cells were obvious. In most patients, GPI-deficient T, B and NK cells were detectable. The proportion of GPI-deficient clones in T, B and NK cells were 78.7%, 53.4% and 30.5%, respectively. There was significant difference among T, B and NK cells (P＜0.01). In two continuous remission cases, no GPI-deficient clones were found in erythrocytes, but there were GPI-deficient T and B cells, and in a 3 year remission there were still GPI-deficient NK cells. Conclusions　 In PNH, similar to other blood cells, lymphocytes also had GPI deficiency, and GPI-deficient T and B cells could exist for a long time. NK cells of PNH patients are the predominant, GPI-deficiency cells with a high frequency (93.3%) and high proportion (78.7%).

　　【Key words】　Hemoglobinuria, paroxysmal；　Lymphocyte；　Antigen,CD₅₅；　Antigen,CD₅₉

　　阵发性睡眠性血红蛋白尿症（PNH )是一种获得性造血干细胞疾病。红细胞膜糖基磷脂酰肌醇(GPI)蛋白(包括CD₄₈、CD₅₅、CD₅₉抗原等)缺失为溶血发作的主要原因。但因PNH临床表现的复杂性，而且并非所有PNH患者的红细胞膜均能发现明显GPI蛋白缺失。为此，我们采用流式细胞术分析PNH患者外周血淋巴细胞亚群数量及T、B淋巴细胞和NK细胞表面GPI蛋白表达情况，以期能深入探讨PNH的本质。

　　病例和方法

　　1　研究对象

　　PNH患者共15例，其中男10例，女5例，年龄22～57岁。初治13例；另2例为随访患者，治疗后持续缓解时间分别为3年及5年。所有病例均符合文献［1］诊断标准。对照组为健康献血员15名，其中男8名，女7名，年龄20～35岁。

　　标本采集：采集外周静脉血5ml，EDTA抗凝。所有标本均在采集后6h内进行测定。

　　2　研究方法

　　2.1　外周血白细胞分类计数：采用自动血细胞计数仪(Coulter LTERSTKS)，将外周血标本中的细胞进行分类计数，各标本均测定3次，取其平均值。该数值用于计算淋巴细胞亚群的绝对值。

　　2.2　外周血淋巴细胞亚群分析：Simultest plus试剂盒由美国BD公司提供，流式细胞仪为美国BD公司的FACScalibur，分析软件为Simulset (美国BD公司)。具体标本处理及分析方法参照试剂盒内说明。

　　2.3　外周血T、B淋巴细胞和NK细胞的CD₄₈、CD₅₅、D₅₉抗原(GPI)测定：采用下列单克隆抗体组合：CD₄₈(CD₅₅、CD₅₉)FITC/CD₃PE、CD₄₈ (CD₅₅、CD₅₉)FITC/CD₁₉PE、CD₄₈(CD₅₅、CD₅₉)FITC/CD₃PE/CD₁₆ CD₅₆Cy5。上述抗体均由PharMingen公司提供。20μl双标或三标抗体与100μl EDTA抗凝血混合后，室温避光孵育25min，加溶血素（BD公司产品）2ml，溶血10min，300×g离心5min，弃上清，PBS (pH7.0) 2ml洗涤1次，300×g离心 5min，弃上清，用体积分数为1%的多聚甲醛固定，避光放置30min以上，上流式细胞仪测定。分析软件为Cell Quest(BD公司产品，Ver 3.0)。

　　2.4　统计方法：组间比较采用t检验。

　　结果

　　1　外周血淋巴细胞亚群分析　正常参考范围(由试剂盒生产厂家提供)：总B淋巴细胞(CD₁₉^＋)为6.4％～22.6%；总T淋巴细胞(CD₃^＋)为59.4％～84.6%；辅助性T淋巴细胞(CD₃^＋ CD₄^＋ )为28.5％～60.5%；细胞毒性T淋巴细胞(CD₃^＋CD₈^＋)为11.1％～38.3%；NK细胞(CD₃^-CD₁₆^＋CD₅₆^＋)为5.6％～30.9%；活化T细胞(CD₃^＋HLA-DR^＋)＜20.0%。15名正常对照者的测定结果基本与上述数据一致。测定15例PNH患者的外周血淋巴细胞亚群，发现所有患者均有不同程度的淋巴细胞亚群异常。其中T淋巴细胞减少者1例(6.7%)；辅助性T淋巴细胞减少者8例(53.3%)；细胞毒性T淋巴细胞减少者4例(26.7%)，增多者2例(13.3%)；B淋巴细胞减少者12例(80.0%)；NK细胞减少者14例(93.3%)；活化T细胞增多者2例(13.3%)。

　　2　外周血T、B淋巴细胞和NK细胞CD₄₈、CD₅₅、CD₅₉抗原的表达　15名正常对照的T、B淋巴细胞和NK细胞表面未发现有GPI蛋白的缺失，其CD₄₈^＋、CD₅₅^＋、CD₅₉^＋细胞均在99%以上。15例PNH患者T、B淋巴细胞和NK细胞表面均有不同程度的GPI蛋白缺失，13例 (86.7%)T淋巴细胞有GPI蛋白缺失，GPI蛋白缺失的T淋巴细胞平均占总T淋巴细胞的30.5%；14例(93.3%）B淋巴细胞有GPI蛋白缺失，GPI蛋白缺失的B淋巴细胞平均占总B淋巴细胞的53.4%；14例(93.3%)NK细胞有GPI蛋白缺失，GPI蛋白缺失的NK细胞平均占总NK细胞的78.7%。从上述数据可得出，NK细胞GPI蛋白缺失率最高，B淋巴细胞次之，T淋巴细胞最低，三者之间的差异有显著的统计学意义（P＜0.01)。在2例已达持续缓解患者中，无红细胞GPI蛋白缺失，但均有T、B淋巴细胞的GPI蛋白缺失，其中1例缓解已达 3年的患者NK细胞有GPI蛋白缺失，但缺失率较低（15.8%）。典型病例的T、B淋巴细胞和NK细胞的GPI蛋白缺失情况见图1。

图1　流式细胞仪检测PNH患者GPI蛋白缺失结果

　　讨论

　　PNH溶血发作的主要原因是由于红细胞膜表面缺乏补体调节分子，如衰变加速因子 (CD₅₉)、反应性溶血膜抑制物(CD₅₅)等。该类分子的缺失，导致红细胞对补体异常敏感。传统上常采用Ham试验作为确诊PNH的主要依据之一，但该试验的敏感性不高，阳性率仅为60%～86%，尤其在一些特殊情况下，如骨髓增生低下，补体敏感红细胞数量不多，或是在急性溶血发作之后，补体敏感红细胞已大部分溶解，实验假阴性率甚高^［1］。近年来，已有采用流式细胞术及单克隆抗体直接测定红细胞膜GPI蛋白来代替Ham试验的倾向，因该技术具有敏感性高，特异性强，结合多种特异性单抗，可同时检测多种细胞表面GPI蛋白缺失，并能发现少量PNH克隆，对早期诊断和鉴别诊断均有很大的帮助^［2］。

　　采用流式细胞术对外周血淋巴细胞亚群进行分析，是目前衡量人体细胞、体液免疫功能状况的较便利的方法之一。我们检测的结果显示，淋巴细胞数量异常是PNH常见的表现，尤以B淋巴细胞和NK细胞的数量减少为明显(分别占80.0%和93.3% )。但这种异常并无特异性，类似的异常也能在再生障碍性贫血中发现。因此在诊断和鉴别诊断中的意义不大，但能否以此作为判断治疗效果和预测预后的指标，须作进一步研究。淋巴细胞亚群数量变化，是否同时伴有功能异常，或导致患者对感染的易感性增高，尚不清楚。但本组所有病例在病程中均没有严重的感染出现。

　　目前已经证实，PNH中血小板、单核细胞和中性粒细胞表面有GPI蛋白缺失^［3］，但对淋巴细胞表面GPI蛋白缺失情况报道尚少，尤其对于NK细胞表面是否有GPI蛋白缺失，尚有争论^［4］。我们采用三色荧光标记，利用数种特异性单抗，达到对NK细胞的精确设门，以此保证了NK细胞的纯度。本研究结果表明，PNH中T、B淋巴细胞和NK细胞上均有不同程度的GPI蛋白缺失，所有患者均为正常细胞群与GPI蛋白缺失细胞群共同存在。T、B淋巴细胞和NK细胞中GPI蛋白缺失的细胞百分比并不相同，其中NK细胞GPI蛋白缺失率最高，B淋巴细胞次之，T淋巴细胞最少，三者之间差异有显著的统计学意义(P＜0.01)。较为特殊的发现是，在2例已达持续缓解患者中，无红细胞膜GPI蛋白缺失，但均有T、 B淋巴细胞GPI蛋白缺失。其中1例缓解已达3年的患者有NK细胞GPI蛋白缺失，但百分比较低(15.8%)。国外曾有报道，长期缓解患者，红细胞GPI蛋白缺失克隆完全消失，但淋巴细胞GPI蛋白缺失现象仍持续存在。我们的结果与此相符。因病例数过少，且随访时间不长，对此结果尚不能下肯定结论，但可以推测，恢复期患者红细胞GPI蛋白缺失细胞消失较快，NK细胞较慢，B、T淋巴细胞GPI蛋白缺失细胞能否消失现尚难肯定，须延长随访时间才能得出确切的结论。T、B淋巴细胞GPI蛋白缺失细胞消失最慢，很可能与其寿命较长有关。至于PNH中各种血细胞出现GPI蛋白缺失现象的早晚是否也与此顺序一样，尚不清楚。

　　根据我们研究结果，与其它血细胞一样，淋巴细胞也存在GPI蛋白缺失现象。T、B淋巴细胞GPI蛋白缺失能较长期存在，而NK细胞GPI蛋白缺失明显，缺陷发生率高(占总病例的93.3%)，缺陷细胞数量多（平均占总NK细胞的78.7%)。因此结合红细胞膜GPI蛋白检测能提高PNH克隆的检出率，尤其在PNH早期，或无溶血表现，红细胞GPI蛋白缺失未能检出的病例中，NK细胞的GPI蛋白的检测可能会有助于诊断和鉴别诊断。

参 考 文 献

　　1，张之南，沈悌，主编. 血液病诊断及疗效标准. 第2版. 北京：科学出版社，1998.

　　2，Beutler E. Paroxysmal nocturnal hemoglobulinuria. In: Beutler E， Lichtman MA, Coller BS，eds. William's Hematology. 5th ed. New York: Mcgraw-Hill Inc, 1995.252-256.

　　3， Kinoshita T, Medof ME, Silber R, et al. Distribution of decay-accelerating factor in the peripheral blood of normal individuals and patients with paroxysmal nocturnal hemoglobulinuria. J Exp Med, 1985, 162: 75-92.

　　4，Tseng JE, Hall SE, Howard TA, et al. Phenotypic and functional analysis of lymphocytes in paroxysmal nocturnal hemoglobulinuria. Am J Hematol, 1995, 50: 244-253.

(收稿日期：1999-09-06)