补肾方对老年性痴呆大鼠学习记忆和细胞因子的影响

中国老年学杂志 2000年第1期第20卷 实验研究

作者：尹兆宝　王健　周如倩　郁志华　林水淼

单位：上海中医药大学老年医学研究所，上海　200032

关键词：补肾方；痴呆；学习记忆；细胞因子

　　摘　要　目的　观察中医补肾方对老年性痴呆大鼠学习记忆行为和血清细胞因子的影响。方法　在s.c.D-半乳糖造成大鼠亚急性衰老的基础上，双侧海马内注射喹啉酸造成类AD模型。以Y-电迷宫和ELISA法分别检测大鼠的学习记忆行为和血清细胞因子。结果　补肾方可显著提高痴呆大鼠的Y-迷宫正确次数，明显降低痴呆大鼠升高的血清IL-2、TNF-α水平。结论　补肾方可通过调整痴呆大鼠的免疫反应而提高其学习记忆能力。

Effects of tonifying the kidney formula on serum cytokines of dementia rats and its memory and behaviour of learning

Yin Zhaobao,Wang Jian,Zhou Ruqian et al

　　(Geriatrics Institute,Shanghai University of Traditional Chinese Medicine,Shanghai 200032)

　　Abstract：Objective　To study the effects of tonifying the kidney formula(TKF) on memory behaviour of learning and serum cytokines of subacute senile dementia rats.Methods　Injecting quinolinic acid into rat hippocampus after injecting D-galactose to form the dementia rat model.Then the memory and behaviour of learning were tested with type-Y electronic maze and serum cytokines were measured with ELISA.Results　TKF could increase the correct numbers of Y-maze of the dementia rats significantly,and the contents of serum IL-2 and TNF-α of the dementia rat could be significantly decreased.Conclusions　TKF might improve the learning behaviour and memory of the dementia rats by regulationg their immune functions.

　　Key words　Tonifying the kidney formula　Dementia　Learning and memory　cytokines

　　Alzheimer病(AD)或原发性老年性痴呆是发生于老年前期和老年期的记忆力进行性减退并影响生活和社会活动能力为特征的大脑退行性变性疾病，是老年期痴呆中最为常见的类型之一^〔1，2〕。目前本病的病因、诊断、治疗等尚无突破性进展，尤其是治疗，尚缺乏理想的方法和药物。本研究在中医相关理论指导下，观察补肾方对老年性痴呆大鼠的学习记忆行为和血清细胞因子的作用，以探索治疗AD的有效中医方药。

　　1　材料和方法

　　1.1　材料

　　1.1.1　实验动物　选用清洁级雄性SD大鼠，体重250～300 g，由上海市计划生育研究所实验动物中心提供。动物购进适应环境3 d后行Y-电迷宫测试，剔除不合格者，称体重后按随机数目表分成对照组、衰老组、模型组和补肾方组。

　　1.1.2　方药组成　补肾方为林水淼教授经验方，由熟地、枸杞、补骨脂、五味子等组成。

　　1.2　方法

　　1.2.1　模型制备　除对照组外，余组均s.c.D-半乳糖50 mg/kg*d×6 w，造成亚急性衰老模型，然后将喹啉酸(QA，Sigma产品)注入衰老大鼠海马，通过QA的神经毒性作用，造成类AD模型。具体方法：模型组和补肾方组大鼠以3%戊巴比妥钠(40 mg/kg体重)腹腔麻醉后固定于脑立体定位仪，剪去颅顶切口区毛，作颅顶正中切口，参照大鼠脑立体定位图谱^〔3〕，选取AP 0.2mm，ML 2.5 mm，DV 7.5 mm，钻开颅骨，以微量注射器垂直进针，每侧海马各注射QA 1 μl(含QA150 nmol/2 μl)，注射时间5 min，留针时间5 min，局部消毒，缝合皮肤。

　　1.2.2　动物用药　补肾方组大鼠于注射QA后第10天开始连续灌服补肾方药液3 w，剂量按成人(60 kg体重)口服剂量的20倍计算，将药液浓缩到1 ml/100 g大鼠体重灌胃，每毫升药液含生药7.25 g。

　　1.2.3　学习记忆行为测试　采用Y-电迷宫法，在暗室中进行。将大鼠移至暗室中适应30 min后开始训练，开始时先将大鼠放入Ⅰ臂端部，给予灯光信号使之适应60 s，然后在另外两臂中任一臂给予灯光信号，示为安全区，操纵电击控制器，予以90 V，10 次/s的电刺激，以大鼠直接逃至安全区为正确反应，否则为错误。待大鼠逃至安全区后灯光继续亮15 s再熄灭，结束一次训练。此时该安全区作为一次训练的起步点，如此连续训练15次。记录正确与错误次数，用药前及用药后分别测试。

　　1.2.4　大鼠血清细胞因子的检测　采用ELISA法。IL-2、INF-γ酶联试剂盒为加拿大ACGT公司产品，TNF-α酶联试剂盒为加拿大YES BIOTECH LABRATORIES公司产品。实验按说明书操作。

　　1.3　统计学处理　实验数据经SPSS统计软件包处理，分别采用t检验和q检验。

　　2　结　果

　　2.1　大鼠学习记忆行为的变化及补肾方的作用　以大鼠Y-迷宫的正确次数计，结果显示：衰老组的正确次数明显低于对照组(P＜0.01)，模型组的正确次数显著低于对照组和衰老组(P＜0.001)，补肾方组正确次数较模型组显著升高(P＜0.05)，而与衰老组无显著差异，但仍显著低于对照组(P＜0.001)(表1)。

表1　大鼠Y-迷宫学习记忆成绩(±s)

　　与对照组比较：1)P＜0.01，2)P＜0.001；与模型组比较：3)P＜0.05，4)P＜0.001

　　2.2　大鼠血清细胞因子的变化及补肾方的作用　见表2。衰老组与对照组比较，血清IL-2和INF-γ含量无显著差异，TNF-α含量显著升高。模型组IL-2和TNF-α含量较对照组显著升高，INF-γ含量无显著变化，TNF-α含量还显著高于衰老组。补肾方组IL-2和INF-γ含量与对照组无显著差异，TNF-α含量则显著高于对照组；IL-2和TNF-α含量较模型组显著降低。

表2　大鼠血清细胞因子含量的变化(±s，pg/ml)

　　与对照组比较：1)P＜0.05，2)P＜0.01，3)P＜0.001；与模型组比较：4)P＜0.05

　　3　讨　论

　　AD的病因与发病机理尚未完全明确，目前缺乏简便的动物模型和有效的治疗方法。以往主要有以下几个方面的动物模型：破坏中枢胆碱能神经系统、实验性自身免疫性痴呆模型、转基因模型、自然衰老模型等，但这些模型或难以全面出现AD的特征性改变或技术要求高，价格昂贵，制作不够稳定，或周期长，难以得到，均限制了其应用^〔4～6〕。

　　应用D-半乳糖导致大鼠亚急性中毒而致动物早衰已被许多实验证实^〔7，8〕。也有报道应用兴奋性氨基酸受体激动剂QA海马内注射，破坏海马胆碱能神经元，造成类AD改变^〔9，10〕。但前者主要为亚急性早衰，后者无衰老基础。本研究将两者结合起来，更贴近AD的学习记忆变化。

　　祖国医学认为，肾与脑紧密相关。认为头者精明之府，脑为髓之海，肾藏精生髓。若肾亏髓枯，脑失所养，则出现记忆、智能、精神等方面的障碍，进而影响全身的生理功能。补肾方即以祖国医学理论为指导，以熟地“滋肾水，益真阴，填骨髓，生精血，通血脉，利耳目”为君；以补骨脂“通命门，敛精神，治肾泄，暖丹田”为臣；以枸杞、五味子“补元气不足，收敛散之气，强阴安神”为佐。全方滋肾阴，补肾阳，益精填髓。

　　本实验中，衰老组大鼠的学习记忆行为已较对照大鼠明显降低，模型组大鼠则较衰老大鼠显著下降，应用补肾方后，该组大鼠较模型大鼠Y-迷宫正确次数有显著增多，表明补肾方可改善模型大鼠的学习记忆能力。

　　以往认为，中枢神经系统(CNS)为受血脑屏障保护的“免疫特免器官”，脑组织仅具有很低的免疫活性。近年来许多研究证明脑组织本身就是一个免疫器官^{〔11，12〕}。在免疫系统中起重要作用的细胞因子及其受体均存在于CNS中，并且发现它们对CNS某些神经元、胶质细胞的生长分化及功能具有调控作用^{〔13，14〕}。白细胞介素2(IL-2)是一种淋巴细胞生长因子，它在CNS中的作用目前不十分清楚。有实验表明，长期注射IL-2到不同年龄的小鼠，发现引起了神经元数目的明显减少。本实验中，衰老鼠的血清IL-2含量较对照组无明显变化，模型鼠则较对照鼠显著升高。经用补肾方后，血清IL-2含量较模型鼠明显降低。

　　TNF-α主要是通过作用于星形细胞而间接引起神经元的损伤。本研究中，模型大鼠血清TNF-α含量比对照和衰老鼠均显著升高，用补肾方后则较模型组显著降低。

　　干扰素(INF)主要由淋巴细胞产生，目前脑组织产生INF的说法不肯定。INF-γ刺激星形细胞的过度增生可能涉及神经细胞的损伤，人胚原代皮层细胞培养中，INF-γ加强了星形细胞受IL-1β刺激后大量NO的释放，而引起神经细胞的死亡。INF-γ又可刺激小胶质细胞的活化，增加炎性因子TNF-α的释放及反应性含氧介导物、NO的产生，而这些结果均可能引起或加重神经细胞的损伤。本研究中，各组大鼠的血清INF-γ含量均无显著差异，与文献报道不一致。以上结果表明，补肾方可明显降低模型大鼠升高的血清IL-2、TNF-α含量，使之恢复或接近衰老或对照大鼠水平，提示补肾方可通过调整机体的免疫状态、改善机体的炎症反应而起到改善学习记忆功能的作用。国家九五攻关项目资助(编号96-906-09-01)

　　作者简介：尹兆宝,男,35岁,博士，主要从事Alzheimer病和老年人心脑血管病的中西医结合研究

　　林水淼,男，教授，博士生导师，主要从事Alzheimer病和老年人心脑血管病的中西医结合研究

　　参考文献

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收稿日期：1998-06-29

修回日期：1999-09-09