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乳腺癌的预防对于降低乳腺癌发病风险具有重要意义。目前大多研究已证实他莫昔芬对ER阳性乳腺癌有确切预防作用，另外一些研究证实中医药具有一定预防作用，如平消胶囊。本研究前期证实阳和化岩汤具有抑制大鼠乳腺癌癌前病变的作用，现从细胞凋亡的角度进一步研究阳和化岩汤在乳腺癌预防中的作用机制。
1 实验材料与研究方法
1.1 实验动物 山东中医药大学实验动物中心提供SPF级SD雌性大鼠，动物生产许可证号：SCXK（鲁）20110003，使用许可证号：SYXK（鲁）2011 0019。
1.2 实验试剂 DMBA购自Sigma公司（批号1650
33）；Fas（批号990984w）和FasL（批号990594w）抗体购自Bioss公司；Bcl-2抗体购自SantaCruz Biote-
chnology公司（批号K0112）；TRIzolReagent购自Invitrogen公司（批号15596-018）。阳和化岩汤：鹿角霜12 g、熟地黄9 g、肉桂6 g、白芥子3 g、莪术12 g、山慈菇15 g、浙贝母片9 g、甘草6 g，购于山东中医药大学附属医院药剂科，水煎浓缩200 mL后，备用。平消片：主要成分郁金、马钱子粉、仙鹤草、五灵脂、白矾、硝石、干漆（制）、枳壳（麸炒），辽宁先锋制药，国药准字Z21021130，批号110603，规格0.24 g。三苯氧胺：宁波市天衡制药，国药准字H33021583，生产批号100902，规格10 mg。
1.3 动物分组、造模和给药方法 ①分组方法：SD大鼠随机抽取14只空白对照组，其他大鼠经造模后随机分为疾病模型组、阳和化岩汤组、平消片组和三苯氧胺组，实验结束时共79只。②造模方法：DMBA（7，12-二甲基苯并蒽）50 mg/kg灌胃，每3周一次，共3次。③给药方法：灌胃。空白对照组给予饮用水；阳和化岩汤组每天4.2 g/kg；平消片组每天0.144 g/kg；三苯氧胺组每天4 mg/kg；疾病模型对照组给予饮用水。药物干预治疗共4周。
1.4 HE染色观察大鼠乳腺组织形态学变化 取大鼠第二对乳腺，福尔马林固定，包埋后连续切片。常规HE染色，中性树胶封片。病理形态学诊断标准参考国家常规标准。
1.5 免疫组化法检测Fas、FasL、Bcl-2蛋白表达 采用SP法检测。结果判定：阳性细胞表达棕黄色颗粒。阳性率为阳性细胞所占比例的平均值。
1.6 Q-PCR法检测Fas、Bcl-2 mRNA表达 RNA提取：用液氮研磨粉碎样本，加入Trizol，分别加酚氯仿、异丙醇，乙醇洗涤，晾干，溶于DEPC；反转录：使用invitrogen试剂盒superscript III（批号18080044）；设计合成引物：Fas：Rattus norvegicus Fas（TNF rece-
ptor superfamily，member 6）（Fas），mRNA，NCBI Re-
ference Sequence：NM_139194.2；Bcl-2：Rattusnorve-
gicus B-cell CLL/lymphoma 2（Bcl-2），nucleargene encoding mitochondrial protein，mRNA，NCBIReference Sequence：NM_016993.1。引物序列：
Fas-F：
GATGACCGTCTTGGCTGTCC；
Fas-R：
CATCGCTGAACGCTACTGGG；
Bcl-2-F：
TGGCTGTCTCTGAAGACGCT；
Bcl-2-R：
CTGCTGACCTCACTTGTGGC。
内参为GAPDH，
序列：大鼠F-AGTTCAACGGCACAGTCAAGG，
GAPDHR-CAGCCTTCTCCATGGTGGTG。
每个样本分别用四对基因引物扩增，以及内参基因扩增，每个反应做3个重复，40循环。基因的表达量用F值表示，数值越大表达量越高。
1.7 统计学方法 SPSS 19.0统计软件包进行数据处理，计量资料结果用x±s表示，采用配对t-test或方差分析。计数资料用百分比表示，采用卡方检验。等级资料的组间比较采用秩和检验。取α=0.05为检验水准。
2 结果
2.1 各组大鼠乳腺组织病理情况比较 与疾病模型组比较，阳和化岩汤组、平消片组及三苯氧胺组可明显降低大鼠乳腺癌的发生率，差异有统计学意义（P＜0.05）；阳和化岩汤组、平消片组与三苯氧胺组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。
2.2 各组大鼠乳腺组织Fas、FasL、Bcl-2蛋白表达情况比较 阳性细胞表现为棕黄色或棕褐色均匀颗粒，Fas、FasL、Bcl-2定位于胞膜、胞浆或胞核。Fas蛋白在空白对照组表达阳性率最高，疾病模型组表达阳性率最低。与疾病模型组比较，阳和化岩汤组、平消片组及三苯氧胺组Fas的表达均升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；与三苯氧胺组比较，阳和化岩汤组、平消片组Fas的表达较低，差异无统计学意义（P>0.05）。FasL蛋白在空白对照组表达阳性率最低，疾病模型组表达阳性率最高；三苯氧胺组FasL的表达较低，与疾病模型组比较差异有统计学意义（P＜0.05）；阳和化岩汤组、平消片组FasL的表达较低，与疾病模型组比较差异无统计学意义（P>0.05）。Bcl-2蛋白在空白对照组表达阳性率最低，疾病模型组表达阳性率最高，各治疗组与空白对照组比较阳性率均升高，差异有统计学意义（P＜0.05），与疾病模型组比较均降低（P＜0.05），差异有统计学意义（P＜0.05）。与阳和化岩汤组比较，平消片组表达阳性率较高，差异无统计学意义（P>0.05），三苯氧胺组阳性率略低，差异有统计学意义（P＜0.05）。
2.3 各组大鼠乳腺组织Fas和Bcl-2 mRNA表达情况比较 大鼠乳腺组织Fas mRNA表达量空白对照组最高，疾病模型组最低，各组与空白对照组比较，均具差异有统计学意义（P＜0.05）。治疗组中平消片组最高，阳和化岩汤组最低，与疾病模型组比较，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。阳和化岩汤组与其他治疗组比较，均差异无统计学意义（P>0.05）。
大鼠乳腺组织Bcl-2mRNA表达量空白对照组最低，疾病模型组最高，各组与空白对照组比较，除三苯氧胺组，其他各组均高，差异有统计学意义（P＜0.05）。治疗组中平消片组Bcl-2 mRNA表达量最高，三苯氧胺组最低，与疾病模型组比较，平消片组差异无统计学意义（P=0.5352）。与阳和化岩汤组比较，三苯氧胺组较高（P＜0.05），与平消片组比较差异无统计学意义（P>0.05）。
3 讨论
3.1 阳和化岩汤对乳腺癌癌前病变Fas/FasL表达的影响 Fas及其配体FasL相互作用是诱导细胞凋亡、保持机体自身稳定的重要机制。Fas是一种跨膜蛋白，属于肿瘤坏死因子受体超家族成员。FasL为Ⅱ型膜蛋白，属于TNF受体/神经生长因子受体及其配体超家族中的成员，是死亡分子Fas的天然配体。一旦Fas和FasL结合，可通过Fas分子启动膜受体途径信号转导，引起随后的级联反应，出现一系列特征性变化，导致细胞发生凋亡。
刘晓红等发现在正常乳腺组织、乳腺腺瘤、乳腺不典型增生、乳腺癌中，Fas阳性细胞的表达率逐渐降低，FasL阳性细胞的表达率呈逐渐升高，其结果有显著统计学意义，认为Fas/FasL参与了乳腺疾病发生发展的全过程，且与乳腺癌临床病理参数密切相关，或可成为评价乳腺癌预后的指标。另有研究发现FasL在不同乳腺组织中表达规律与Fas相反：在乳腺癌的表达最高，其次是乳腺腺瘤和乳腺不典型增生等良性病变，正常乳腺组织表达最低。李湘奇研究结果显示在乳腺增生病模型大鼠中Fas表达较低，FasL表达较高，经疏肝健脾方等药物干预后，能够增加Fas在乳腺组织中的表达，降低FasL的表达，从而认为疏肝健脾方通过提高Fas及降低FasL蛋白的表达，促进细胞凋亡，从而抑制/逆转乳腺增生。
本次大鼠乳腺组织Fas蛋白表达阳性率实验结果显示，各治疗组与疾病模型组比较阳性率均高，其中阳和化岩汤组较三苯氧胺组表达阳性率低，较散结化痰汤组和平消片组阳性率高。大鼠乳腺组织Fas mRNA表达结果显示，阳和化岩汤组与其他治疗组比较均无统计学差异（P>0.05）。说明阳和化岩汤可提高乳腺组织Fas和Fas mRNA的表达，作用优于散结化痰汤和平消片。阳和化岩汤组较三苯氧胺组FasL蛋白表达阳性率高，较散结化痰汤组和平消片组阳性率略低，说明药物干预治疗均可降低乳腺组织FasL的表达阳性率。
3.2 阳和化岩汤对乳腺癌癌前病变Bcl-2蛋白和mRNA表达影响 Bcl-2（B淋巴细胞瘤-2基因）主要定位于线粒体膜、核膜和内质网膜上，是线粒体凋亡的主要调控因子，也是最早被认识的抗凋亡基因。Kluck等与Kim等发现Bcl-2可以通过抑制线粒体释放细胞色素C来抑制凋亡，而Zhivotovsky等用两种不同的方法证明了即使细胞色素C已经释放入胞浆，Bcl-2仍能延迟细胞死亡。张印春等观察乳腺癌浸润性导管癌组织中Bag-1、Bcl-2以及Bax的表达变化，结果浸润性癌组织中Bcl-2阳性表达率为78.8%，癌旁正常乳腺组织中为58.8%，差异有统计学意义，结论认为乳腺浸润性癌组织中Bcl-2高表达，Bcl-2可能参与了乳腺组织由良性向恶性转化的过程。李朝平等检测抗凋亡基因（Bcl-2）、增殖细胞核抗原（PCNA）基因表达与乳腺增生病组织学的相关性，通过乳腺增生病癌变趋势的生物学指标研究探讨通乳散癖汤对乳腺增生病的干预治疗作用，结果通乳散癖汤能够调整实验大鼠乳腺组织Bcl-2、PCNA的表达水平。王非等认为中药消癖汤能够降低实验大鼠乳腺组织PCNAmRNA、BcL-2mRNA、VEGFmRNA的阳性表达水平，其作用与逍遥散、三苯氧胺相似。
本实验研究结果显示，各治疗组与疾病模型组比较Bcl-2蛋白阳性率均降低，阳和化岩汤组较平消片组阳性率高，与三苯氧胺相似。Bcl-2 mRNA表达量除三苯氧胺组，其他各组Bcl-2 mRNA表达量均高，差异具有统计学意义（P＜0.05）。阳和化岩汤组与其他治疗组比较，较三苯氧胺组高，与其他治疗组差异无统计学意义（P＜0.05）。提示阳和化岩汤具有降低Bcl-2蛋白和mRNA表达的作用。
乳腺癌的发生是一个渐变过程，垄居中《外科活人定本》曰：“此症生于正乳之上，乃厥阴、阳明经之所属……何谓之癖，硬而不痛，如顽核之类，过久则成毒”。因此本病是在肾阳亏虚、冲任失调基础上，气机凝滞，寒痰凝结，瘀血内阻，搏结于乳络而成，当以温肾助阳、调摄冲任、化痰散结、活血化瘀为治则。阳和化岩汤方中血肉有情之鹿角胶温补肝肾、填精补髓以治其本；肉桂功补火温阳散寒，土贝母苦寒化痰散结，莪术破血行气，三药并用为臣；山慈菇化痰散结，三棱破血行气，白芥子化痰散结，共为佐药；甘草为使。全方温肾助阳与化痰散结、活血祛瘀并用，主要用于乳腺增生病、乳腺癌癌前病变及早期乳腺癌。本研究验证阳和化岩汤具有预防乳腺癌的作用，并通过膜受体和线粒体途径发挥促进细胞凋亡的作用机制，为乳腺癌的中医药预防提供了充分的依据，从而丰富了中医“治未病”的理论和内容。
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