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不同炮制辅料对三七皂苷成分及抗血小板聚集作用的影响
三七为五加科人参属植物三七Panax notoginseng (burk.) F.H.Chen的干燥根或根茎。味甘、微苦, 温, 归肝、胃经, 具有散瘀止血, 消肿定痛之功, 其主要活性成分为三七总皂苷[1,2,3]。三七的主要炮制品有三七粉、熟三七粉。三七经过蒸制加工后为熟三七, 具有显著的补血作用[4]。除蒸制法外, 熟三七加工炮制文献报道还有油炸法及砂炒法[5,6,7]。《中医药大辞典》记载熟三七可补益健体[8]。
中药炮制辅料是指具有辅助作用的附加物料, 它对主药起协调作用, 或增强疗效、或降低毒性、或减轻不良反应、或影响主药的理化性质, 主要分为液体 (及半固体) 辅料与固体辅料[9]。液体辅料主要包括:酒、醋、盐 (水) 、蜂蜜、生姜汁、甘草汁、黑豆汁、胆汁、麻油、米泔水等[10]。目前利用不同辅料对三七炮制, 炮制前后功效变化较少人进行研究。本文选择常用炮制液体辅料对三七进行炮制研究, 采用HPLC法对不同炮制三七皂苷成分进行了比较研究, 探讨经过加工后, 各三七样品所含的皂苷类成分的变化;同时比较不同辅料炮制品, 对ADP诱导的血小板凝集的抗凝集作用。为进一步研究熟三七的炮制方法和药理作用奠定基础。
材料
2.试剂对照品人参皂苷Rg1 (1100703-201027) 、人参皂苷Rb1 (110704-201123) 、三七皂苷R1 (110745-201119) 、人参皂苷Re (110754-201221) 、人参皂苷Rd (111818-201001) 购自于中国药品生物制品检定所。二磷酸腺苷 (ADP) 购自SigmaAldrich, 乙腈为色谱纯, 水为Milli-Q纯化水, 其他试剂均为分析纯。
3.仪器1200高效液相色谱仪 (美国Agilent公司) ;电子天平 (德国Sartori-us公司) ;B8510E超声波清洗器 (美国Branson公司) ;热风循环烘箱 (北京北方利辉试验仪器设备有限公司DHG-9035AD) ;普利生 (PRECIL) LBY-NJ四通道血小板聚集仪。
方法与结果
1.样品制备将鲜三七清洗, 晾干表面水分, 切成约2mm厚的片状, 待用。样品用不同辅料 (A.直接干燥;B.姜汁2h、C.姜汁4h、D.姜汁6h;E.蜂蜜2h、F.蜂蜜4h、G.蜂蜜6h;H.盐水2h、I.盐水4h、J.盐水6h;K.油炸三七;L.糖2h、M.糖4h;N.红糖2h、O.红糖4h、P.红糖6h;Q.醋2h、R.醋4h、S.醋6h;T.黄酒2h、U.黄酒4h、V.黄酒6h;W.水蒸2h、X.水蒸4h、Y.新鲜三七) 润1h时, 按2、4、6h的时间直接进行蒸制, 取出蒸好的样品, 置于烤盘上, 用热风循环烘箱60℃烘干, 备用。
2.色谱条件717自动进样器;C18柱 (250mm×4.6mm, 5μm) 。流动相:水 (A) -乙腈 (B) 为流动相, 梯度洗脱 (A%为80%→80%→55%→55%→25%→25%→0%, 相应时间周期为0→30min→60min→60.01min→78min→78.1min→80min) 。检测波长203nm, 流速1.0m L/min, 进样量10μL, 理论塔板数按Rg1计算应不低于3 000, 各组分的分离度应符合要求。
3.供试品溶液与对照品溶液的制备
3.1对照品溶液的制备精密称取干燥至恒重的人参皂苷Rg1、Rb1、Re、Rd和三七皂苷R1对照品适量, 加甲醇分别制成各1m L含人参皂苷Rg1、Rb1、Re、Rd、三七皂苷R1各0.2mg的对照品溶液。
3.2供试品溶液的制备精密称取供试品粉末0.25g, 精密加入甲醇25m L, 称定重量, 超声处理45min, 放置至室温, 用甲醇补足减失的重量, 摇匀, 1 000r/min离心10min, 取上清液, 微孔滤模过滤, 备用。
4.线性关系考察取已配制好的对照品溶液, 按上述色谱条件测定。以对照品的质量浓度 (X) 为横坐标, 峰面积积分值 (Y) 为纵坐标, 进行线性回归, 得Rg1线性回归方程Y=3 542.9X-2 823.9 (R2=0.9992) ;Rb1线性回归方程Y=3 077.4X-5 567.6 (R2=1) ;R1线性回归方程Y=2 995.9X-1 957.9 (R2=0.9994) ;Re线性回归方程Y=3 502.7X-7 260.4 (R2=0.9998) ;Rd线性回归方程Y=3 042.5X+1 471 (R2=0.9994) 。结果表明, 人参皂苷Rg1、Rb1、Re、Rd和三七皂苷R1的质量浓度均在0.01~0.2mg/m L范围内与各自峰面积积分值呈良好的线性关系。
5.方法学考察
5.1精密度试验取样品W按供试品溶液进行处理, 按“2.”项下色谱条件, 精密进样6次。人参皂苷Rg1、Rb1、Re、Rd、三七皂苷R1的RSD值分别为1.14%、1.03%、0.97%、1.19%、1.35% (n=6) , 表明仪器精密度良好。
5.2稳定性试验参照“3.2”项下方法制备W供试品溶液, 分别于0、2、4、6、8、12h按上述色谱条件进样分析。结果人参皂苷Rg1、Rb1、Re、Rd、三七皂苷R1的RSD值为1.18%、0.83%、0.97%、1.06%、0.91% (n=6) , 表明供试品溶液至少在12h内稳定性良好。
5.3重复性试验取W编号三七粉末适量, 共6份, 分别按“3.2”项方法制备供试品溶液, 参照“2.2”项色谱条件进行测定。结果人参皂苷Rg1、Rb1、Re、Rd和三七皂苷R1的平均含量的RSD值分别为1.57%、0.96%、1.15%、1.48%、1.08% (n=6) , 表明本方法重现性良好。
5.4加样回收率试验取已测得含量的A (干品) 三七粉末6份, 每份0.12g, 分别按“3.2”项方法制备供试品溶液, 精密加入对照品溶液 (每毫升分别含三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、Re、Rb1及Rd对照品1.265、3.223、0.574、2.561、0.741mg) , 照上述色谱条件进行测定, 计算人参皂苷Rg1、Rb1、Re、Rd和三七皂苷R1的平均加样回收率。结果人参皂苷Rg1平均回收率为97.94%, RSD=1.72%;人参皂苷Rb1平均回收率为98.91%, RSD=1.57%;三七皂苷R1平均回收率为102.75%, RSD=1.59%;人参皂苷Re平均回收率为98.32%, RSD=1.75%;人参皂苷Rd平均回收率为103.81%, RSD=1.67%。
6.样品含量测定取炮制好的样品各0.25g, 精密称定, 分别按“3.2”项下方法制备供试品溶液, 照“2.”项色谱条件进样测定, 根据回归方程计算人参皂苷Rg1、Rb1、Re、Rd和三七皂苷R1的含量及5个单体含量总和。结果见表1, 样品色谱图见图1。
图1 样品HPLC色谱图
含量测定结果表明, 三七经不同溶液炮制后, 皂苷含量明显下降, 随着蒸制时间的增加, 含量下降越明显。
不同炮制品二醇型皂苷 (PPD=Rd+Rb1) 与三醇型皂苷 (PPT=R1+Rg1+Re) 与鲜品比较, 呈明显上升趋势。
表1 不同炮制样品皂苷含量 (n=3)
7.抗血小板聚集试验兔耳缘静脉取血, 用3.8%的枸橼酸钠抗凝 (血与抗凝剂的体积比为9∶1) , 置于50m L容量瓶中, 混匀后按不同的离心速度制备富血小板血浆 (PRP) 和贫血小板血浆 (PPP) 。在室温下1 000r/min离心10min, 取上层血浆得PRP。4 000r/min离心20min, 取上层血浆得PPP。添加250μL PPP到玻璃瓶预热5min。添加250μL PRP在有搅拌的玻璃小瓶中, 把PRP瓶子放进测量室, 加入10μL ADP溶液, 进行测定。
图2 各样品PPD/PPT值
重复以上步骤, 直到样品全部检测完。测试结果见图3。
图3 不同炮制样品抗血小板抑制率
讨论
1.炮制溶剂及时间对皂苷含量的影响随着炮制时间的增长, 皂苷含量呈下降趋势;使用炮制溶剂炮制品与直接蒸制样品, 皂苷含量无显著区别, 因此炮制溶剂对皂苷影响有待进一步研究。同时对检测出的PPD与PPT进行了比较, 不同溶剂及加工时间加工样品, 与鲜品比较PPD/PPT比值均呈上升趋势, 熟三七的补益作用是否与比值的显著变化有关系, 有待进一步研究。
2.炮制样品抗血小板聚集影响不同炮制溶剂样品对血小板的聚集率与炮制时间、皂苷含量等没有明显的量效关系, 油炸三七的抗血小板凝集抑制率最高, 但其皂苷类成分变化并不明显。这可能与油炸三七时是瞬间受热, 三七所含的酶被破坏, 没有来得及降解皂苷类成分。但为什么经过油炸其抗血小板凝集作用增强有待进一步深入研究。
参考文献
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[2]王晓燕, 张腾.三七总皂苷双向调节新血管生成作用研究进展.中华中医药杂志, 2013, 28 (6) :1818-1822
[3]黄家林, 田代雄.三七总皂苷抗炎免疫药理研究进展.中华中医药杂志, 2016, 31 (11) :4657-4660
[5]唐第光.三七炮制方法研究——油炸法.中成药, 1991, 13 (7) :18-19
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[7]周新惠, 赵荣华, 张荣平, 等.三七不同加热炮制品中5种皂苷类成分的含量测定.云南中医学院学报, 2013, 36 (6) :11-15
[8] 中国医药大辞典.上海:中新书局, 1982
[9]江丽芸.中药辅料的研究.中国实用医药, 2012, 36 (7) :249
[10]袁星, 杨添钧, 黎量, 等.中药炮制用辅料的现况及对策.中药与临床, 2015, 6 (1) :62-64
来源：中华中医药杂志 作者：高明菊 马妮 朱琳 周家明 冯光泉 董婷霞 段然
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