支气管哮喘淋巴细胞Fas抗原的表达

中华结核和呼吸感染 1998年第4期第0卷 论著

作者：张劭夫　刘树芬　张波　徐军　高长兴

单位：250031 济南，济南军区总医院呼吸科(张劭夫、刘树芬、张波、徐军)；解放军第54871部队(高长兴)

　　关键词： 哮喘；糖皮质激素类

　　【摘要】　目的　探讨哮喘患者淋巴细胞Fas抗原的表达状况。方法　取哮喘患者外周血淋巴细胞,加入地塞米松10^-5mol/L进行细胞培养,分别于0、2、8、24小时以流式细胞仪测定淋巴细胞表面的Fas(CD₉₅)抗原。结果　哮喘患者淋巴细胞Fas抗原的自发表达较正常对照组低，哮喘组Fas为5.3%±20%，正常组为8.5%±1.8%，(P＜0.05)。体外经地塞米松诱导后其Fas抗原表达显著增加(P＜0.01)。结论　哮喘患者免疫亢进可能与免疫细胞Fas抗原自发性降低有关。地塞米松可诱导淋巴细胞Fas抗原的高表达，可能是地塞米松诱导细胞凋亡的机理之一。

The expression of Fas antigen on lymphocytes in the patients with asthma

Zhang Shaofu, Liu Shufen, Zhang Bo, et al. Respiration Department, Gerenal Hospital of Jinan Command of PLA, Jinan 250031

　　【Abstract】　Objective　To study the expression of Fas antigen on lymphocytes in patients with asthma.Method　The peripheral blood lymphocytes (PBL) isolated from patients with asthma were cultured with dexamethasone 10^-5mol/L, Fas antigen on lymphocytes was detected by flow cytometry at 0, 2 nd, 8 th, 24th hour respectively. Result　The native expression of Fas antigen of PBL isolated from the patients with asthma (5.3%±2.0%, P＜0.05) was lower than that from healthy controls (8.5%±1.8%). Increased expression of Fas antigen in the patients with asthma was observed with induction of dexamethasone (P＜0.01). The percentages of Fas positive cell were 5.3%±2.0%, 33%±5%, 63%±11%, 76%±7% at 0, 2nd, 8 th, 24 th hour respectively in asthmatic group. While 8.5%±1.8%, 31%±11%, 49%±10%, 20%±4% respectively in normal control group.Conclusion　Decreased native expression of Fas on lymphocytes may be related to airway inflammation in the patients with asthma. Increased expression of Fas induced by Dex may be one of the mechanism of lymphocytes apoptosis.

　　【Key words】　Asthma　　Glucocorticoids

　　细胞凋亡现象日益受到人们的关注，与坏死不同，细胞凋亡是在基因控制下核酸内切酶激活的结果。Fas分子是死亡因子Fas配体（Fas　L）的受体。Fas／Fas L系统在免疫活性细胞的外周克隆清除（Peripheral clonal deletion）中具有重要作用,Fas/Fas L功能异常可能是自身免疫性疾病的发病机理之一^［1］。哮喘气道炎症过程中有明显免疫活性细胞功能亢进和细胞因子分泌增强,我们通过体外对哮喘患者外周血中淋巴细胞经地塞米松(DEX)诱导后Fas表达的研究,旨在探讨Fas系统在哮喘炎性细胞调节中的可能作用,并进一步阐明糖皮质激素治疗哮喘的机理。

　　对象与方法

　　1.研究对象：哮喘患者5 例,男3 例,女2例,平均年龄32岁,均符合1993年全国哮喘会议诊断标准。受试者取血时均停用糖皮质激素1周以上。健康对照组5名, 男3名,女2名,平均年龄35岁。

　　2.主要试剂和设备：(1)地塞米松为美国Sigma公司产品。(2)异硫氰酸(FITC)标记的鼠抗人CD₉₅单克隆抗体,法国国际免疫公司产品。(3)FACScan流式细胞仪为美国BD公司生产。

　　3.方法：(1)分离外周血单个核细胞。无菌取静脉血10 ml,肝素抗凝,加等量Hank液稀释,以2倍体积置于Ficoll-Hypaque分离液上,2 000 r/min离心20分钟,收集界面细胞,以Hank液洗涤3次后,台盼蓝染色活细胞比＞97%。(2)外周血淋巴细胞培养及DEX诱导：以含20%小牛血清的RPMI 1640培养液及10^-5mol/L浓度的地塞米松制备淋巴细胞培养悬液,分别将其分装在4支培养管中,置于5%CO₂孵箱中进行细胞培养,同时设不加DEX的对照管,分别于0、2、8、24小时取培养淋巴细胞悬液进行膜Fas抗原流式细胞术分析。(3)Fas抗原的流式细胞术测定：保持细胞悬液浓度1×10⁶/ml,加入FITC标记的CD₉₅单克隆抗体,室湿下反应20分钟,以2 000 r/min离心5分钟,再以PBS洗涤淋巴细胞2次。弃上清液后,上流式细胞仪进行检测,收集2万个细胞,上机前先以标准荧光微球调整仪器,使变异系数稳定在2%左右,以Macintosh 650计算机处理数据。

　　4.统计学方法采用t检验。

　　结果

　　一、外周血淋巴细胞Fas抗原的自发表达

　　哮喘患者外周血淋巴细胞Fas抗原的自发表达较正常对照组低，哮喘组5例，Fas抗原的自发表达为5.3%±2.0%(P＜0.05)，对照组5名，Fas抗原的自发表达为8.5%±1.8%(P＜0.05)。

　　二、地塞米松体外诱导哮喘患者外周血淋巴细胞Fas抗原的表达

　　嗜喘患者体外细胞培养地塞米松诱导Fas抗原的表达见附图。

附图　地塞米松体外诱导Fas抗原表达

　　讨论

　　Fas/Fas L系统在细胞凋亡过程中发挥重要作用。细胞凋亡的重要生物学意义之一是对免疫细胞进行选择,使机体保持稳定。在胸腺内,与胸腺所表达的自身主要组织相容性复合物(MHC)相一致的T细胞被保留下来,称为阳性选择。这部分T细胞不会通过凋亡的形式死亡。而强烈与自身MHC反应的T细胞则通过细胞凋亡形式死亡,此称为阴性选择。大部分T细胞在胸腺内进行阴性选择,仅一小部分迁移入外周淋巴器官成为成熟淋巴细胞。在外周组织中被抗原激活的淋巴细胞可再次经过阴性选择而去除。在免疫细胞的阴性选择过程中Fas/Fas L系统发挥重要作用。如果Fas/Fas L功能缺损则必然使免疫细胞的阴性选择发生障碍,其结果导致免疫活性细胞过量积聚。具有自身免疫病特征的淋巴细胞增生(lpr)性鼠的过量免疫活性细胞存在,Fas抗原基因缺陷是主要原因之一^［2］。提示Fas抗原基因缺陷是诸如系统性红斑狼疮等自身免疫病的发病原因之一。关于哮喘患者免疫细胞Fas表达的情况, 国外近年来已有报道，但主要是对嗜酸细胞凋亡和Fas表达的研究^［3，4］。我们发现, 哮喘患者外周血淋巴细胞Fas抗原表达较正常对照组低,提示哮喘患者免疫活性细胞可能亦存在Fas基因缺陷。Fas的低表达可能是哮喘患者免疫活性细胞功能亢进和炎性细胞因子过量释放的原因之一。

　　以DEX对哮喘患者外周血淋巴细胞进行体外诱导,发现随着时间的增加,淋巴细胞Fas抗原的表达明显增加，而对照组Fas的表达于培养8小时达到高峰,之后呈下降趋势。尽管在DEX诱导的0小时哮喘外周血淋巴细胞Fas表达较正常对照组为低,但DEX诱导的2、8及24小时各时间点均较正常为高,提示DEX更易诱导哮喘患者Fas抗原的表达,其机理有待进一步研究。已知DEX可显著诱导免疫活性细胞凋亡^［5］,推测DEX可能是通过启动Fas基因表达Fas分子而促使免疫细胞凋亡。DEX及其它诱导Fas抗原表达、促使免疫细胞凋亡的物质,对于哮喘气道炎症控制的研究具有诱人的前景。

　　参考文献

　　1　Nagate S, Golstein P. The Fas death factor. Science,1995,267:1449-1455.

　　2　Thompson CB. Apoptosis in the pathogenesis and treatment of disease. Science，1995，267:1456-1462.

　　3　Matsumoto K, Schleimer RP, Saito H, et al. Induction of apoptosis in human eosinophils by anti Fas antibody treatment in vitro. Blood，1995, 86:1437-1443.

　　4　Simon HU, Yousefi S, Dommann-Scherrer CC, et al. Expansion of cytokine-producing CD₄-CD₈-T cells associated with abnormal Fas expression and hypereosinophilia. J Exp Med, 1996, 183: 1071-1082.

　　5　王艳华, 杨贵贞. 地塞米松诱导大鼠免疫细胞凋亡机制初探.中国免疫学杂志，1996，12:222-224.

(收稿：1997-09-17　　修回：1998-01-16)