哮喘患者外周血嗜酸性粒细胞抗体的表达及临床意义

中华结核和呼吸感染 1998年第10期第21卷 论著

作者：黄宏　徐军　钟南山

单位：510120 广州，广州呼吸疾病研究所(黄宏现在武汉同济医科大学附属同济医院内科)

　　关键词： 哮喘；嗜酸性粒细胞；抗体

　　【摘要】　目的　评价哮喘患者外周血EG1和EG2的表达及与哮喘严重程度的关系。方法　采集68例哮喘患者、慢性阻塞性肺疾病(COPD)及健康人外周静脉血，经细胞膜穿透法（FOG）处理后用荧光标记，在流式细胞仪上进行分析。结果　29例症状性哮喘患者外周血EG1的平均荧光强度（MFI）是1 238±807,阳性细胞百分比是70%±19%；EG2的MFI为1 002±658，阳性细胞百分比为79%±18%；13名健康对照组EG1的MFI为435±98，阳性细胞百分比为56%±22%；EG2的MFI为404±80，阳性细胞百分比为58%±22%；14例哮喘缓解期患者EG1的MFI为605±439，阳性细胞百分比为64%±19%，EG2的MFI为614±404，阳性细胞百分比为69%±16%；12例COPD急性发作期患者EG1的MFI为440±115，阳性细胞百分比为52%±16%，EG2的MFI为407±151，阳性细胞百分比为53%±14%；P＜0.05。且与哮喘发作时的程度正相关：EG1的MFI与症状相关(r=0.70，P＜0.01)；EG2的MFI与症状相关(r=0.77，P＜0.05)。结论　EG1和EG2的表达，反应哮喘气道的严重程度，可以作为判断气道炎症的指标之一。

　　The changes of EG1 and EG2 positive eosinophils and their clinical significance in asthmatics　　HuangHong, XuJun, Zhong Nanshan. Guangzhou Institute of Respiratory Disease,Guangzhou 510120

　　【Abstract】　Objective　To evaluate the significance of EG1 or EG2 positive eosinophils in relating to the severity of asthma.Method　EDTA-anticoagulated venous blood were treated by FOG method, and FITC-conjugated monoclonal antibodies were added. Flowcytometry technique was used.Result　EG1 and EG2 positive eosinophils increased significantly in patients with acute asthma (n=29) as compared with control (n=13) and COPD (n=12),P＜0.05.There were significant correlation of the mean fluorescence intensity(MFI) between EG1,EG2 and the degree of the symptom.Conclusion　There is a significant increase of activated eosinophils in peripheral blood in asthmatics, the expression of EG1 and EG2 positive eosinophils correlated well with the severity of symptom in asthmatics. EG1 and EG2,as the marker for eosinophils activity, may be sensitive and specific in evaluating the severity of asthmatics symptom.

　　【Key words】　Asthma　　Eosinophil　　Antibody

　　支气管哮喘是由多种细胞特别是肥大细胞，嗜酸性粒细胞（EOS）和T淋巴细胞参与的慢性气道炎症。EOS的聚集和激活在哮喘的气道炎症中起着关键性的作用。EOS的胞浆中含有多种特殊的蛋白质颗粒，主要有主碱基蛋白（MBP），嗜酸性阳离子蛋白（ECP），嗜酸性细胞衍生的神经毒素（EDN）和嗜酸性细胞过氧化物酶（EPO），所有这些蛋白质均有强力的细胞毒毒性，哮喘的许多病理生理改变是EOS释放的这些蛋白质所致。单克隆抗体EG1能特异性地识别ECP，EG2能特异性地识别ECP和EDN。有研究表明^［1］，EG1反映储存的EOS，EG2反映激活的EOS。我们通过流式细胞仪测定哮喘患者外周血EG1和EG2阳性的EOS，旨在探讨活化的EOS与哮喘严重程度的关系。

对象与方法

　　1.试验对象：(1)健康对照组：选择本院保健科集体体检正常者13名，其中男8名，女5名，年龄18～58岁。均无明显心、肝、肾等疾病，无吸烟史或戒烟2年以上，无过敏性疾病及其它变态反应有关的疾病。(2)哮喘组：其中症状性哮喘29例，男18例，女11例，年龄5～58岁。本次有喘息，胸闷，气紧，咳嗽等不同程度的症状，并按WHO标准^［2］进行症状分级，沙丁胺醇喷雾与支气管扩张试验一秒钟用力呼气容积占用力肺活量比值（FEV₁％）＞15%或组胺支气管激发试验阳性，且至少1个月内未用过激素类药物。(3)哮喘缓解期组14例，男7例，女7例，年龄7～49岁。均为接受口服强地松或吸入表面激素治疗缓解后的患者，其中包括有9例哮喘患者是自身治疗前后的对照。(4)COPD合并急性感染组12例，男7例，女5例，年龄42～73岁。均为我院呼吸科新入院的患者，有咳嗽、咳痰，气促等不同程度的症状。哮喘患者除了进行肺功能和血EG1和EG2检查外，部分患者还进行了血清ECP测定。

　　2.实验主要试剂：(1)单克隆抗体抗人EG1(100 μg/L) 1 ml由Kabi Phamacia试剂公司提供。(2)单克隆抗体抗人EG2(100 μg/L) 1 ml由Kabi Phamacia试剂公司提供。(3)鼠抗人IgG1(100 μg/L) 1 ml由DAKO公司提供。(4)抗鼠FITC(100 μg/L) 2 ml由DAKO公司提供。

　　3.实验方法：(1)血清ECP的测定：采集静脉血2 ml在普通玻璃管中，20±2℃凝血60分钟，2 000 r/min离心10分钟，取上清于一洁净的1.5 ml微量离心管(Eppendor)-40℃冰箱储存(凡溶血或凝血不良的标本除外)。用荧光酶联免疫法在发玛西亚CAP检测系统中进行血清ECP水平的测定（Parmacia提供药盒）。(2)EG1和EG2的测定：采集静脉血0.1 ml于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝血的玻璃管中，加入4 ml裂解液裂解红细胞，离心5分钟，去上清，各100 μl经裂解的白细胞分别加入140 μl 4%多聚甲醛(PFA)室温下固定10分钟，140 μl 0.74%N-辛基-β-D-吡喃葡萄糖(OG)穿透6分钟(即细胞膜穿透法)，然后分别加入EG1和EG2各2 μl为第二抗体，IgG1为阴性对照，最后用PBS稀释后进行流式细胞仪分析。分析的细胞数每个试管不少于5 000个，结果用平均荧光强度(MFI)及阳性细胞百分比表示。

　　4.统计学分析：数值以±s表示，两组间的比较用t检验，治疗前后对照用成对t检验，相关分析用直线回归法。

结果

　　一、症状性哮喘患者与健康对照组血清ECP浓度的比较

　　12例症状性哮喘患者血清ECP浓度为13±9 μg/L，14名健康对照组血清ECP浓度为8±4 μg/L，二组比较P＞0.05。

　　二、哮喘患者EG₁和EG₂的MFI值比较

　　29例症状性哮喘患者EG1和EG2的MFI值均显著高于健康对照组(P＜0.01);EG1和EG2阳性细胞百分比高于健康对照组(P＜0.05)。症状性哮喘患者EG1的MFI值显著高于14例缓解期患者(P＜0.05);EG1和EG2阳性细胞百分比高于缓解期患者(P＜0.05，附表)。

　　三、EG1和EG2的MFI与症状分级的关系

　　29例症状性哮喘患者按症状分级，其中1级10例，EG1的MFI为786±435，EG2的MFI为662±349；2级9例，EG1的MFI为994±199，EG2的MFI为932±262；3级6例，EG1的MFI为1 764±730，EG2的MFI为1 687±857；4级4例，EG1的MFI为1 815±994，EG2的MFI为1 857±1 017。相关分析表明：EG1的MFI与症状分级呈正相关(r=0.70，P＜0.01)；EG2的MFI与症状分级呈正相关(r=0.77，P＜0.05)。

　　四、9例哮喘患者治疗前后的比较

　　9例哮喘患者治疗前EG1的MFI为1 193±474，EG2的MFI为838±448，治疗后EG1的MFI为854±520，EG2的MFI为744±467，P＜0.05。

附表　四组患者EG1和EG2的MFI值比较(x±s)

　　注：均与症状性哮喘组比较

讨论

　　细胞膜穿透技术即先用PFA固定白细胞膜，然后用OG穿透，这种技术用于流式细胞仪上检测细胞内抗原^［2，3］。

　　Hed等^［4］用该技术从少量外周血中通过荧光标记直接分辨出EOS，他们的研究表明：该方法从外周血中分辨出EOS，简单，易行。我们的结果和Hed报道的大致相同。

　　血清ECP是反映体内血浆ECP水平的综合结果。Venge等^［3］在研究中认为：血清ECP的浓度是判断哮喘气道炎症的指标。然而，实验表明，血清ECP浓度受患者生理状态及实验条件（如凝血和温度等）诸多因素的影响，广州呼吸疾病研究所的黄海鹭等在进行广州地区健康人群和哮喘患者外周血ECP水平的研究中发现，在103例成年哮喘患者中，在20℃下只有30%的患者血清ECP水平高于正常值，因而认为将血清ECP作为反应慢性哮喘患者气道炎症的一个指标，不够特异。我们也测定了29例哮喘发作期患者中12例患者与14名正常人血清ECP浓度，发现在20℃下，尽管哮喘患者血清ECP增高，但与正常人比较差异无显著性。可见，血清ECP不能灵敏地反映气道炎症，它仅反映一个总体趋势，因而有必要寻找更特异的指标。

　　1984年Tai报道单克隆抗体EG1可识别储存的EOS，EG2识别活化的EOS。但是，Jahnsen^［5］在免疫组织化学中发现，用甲醛固定的正常人外周血标本，EOS全都表达为EG2阳性，如果不固定表达为64%，用丙酮固定表达为60%。另外，鼻粘膜炎症的冰冻切片用甲醛固定后EG2的表达明显高于用丙酮固定的标本（P＜0.03）。这些研究表明，用免疫组织化学的方法，EG2的表达至少部分由于联接了非EOS的细胞而受到抑制。

　　Hed等^［4］用流式细胞仪分析EG1和EG2的表达，发现症状性哮喘患者EG1和EG2的表达明显高于健康人，而且，如果周围血白细胞先经37℃孵育后再进行OG处理，EG2的表达会更加明显。因而认为EG2作为激活状态的EOS特征性标志，可以作为哮喘患者气道炎症的一个诊断指标。我们采纳此种OG法检测了症状性哮喘，哮喘缓解期，COPD患者及健康对照人群外周血EG1和EG2的表达。发现，症状性哮喘患者EG1、EG2的MFI及其阳性细胞百分比均明显高于哮喘缓解期患者和健康人，而且在9例哮喘患者，其治疗前后EG1和EG2的MFI差异均有显著性。上述结果表明，EG1和EG2的水平反应哮喘气道炎症的状态具有一定的灵敏性。而且比血清ECP的灵敏性高，可以对具体患者的诊断和疗效观察提供比较可靠的信息。在同COPD患者的比较中，发现COPD急性发作期患者EG1和EG2的MFI及阳性细胞百分比均显著低于症状性哮喘患者。表明EG1和EG2的水平反应哮喘气道炎症的状态具有一定的特异性。从总体上讲，随着哮喘症状的逐渐加重，EG1和EG2的MFI逐渐升高。说明：不论EG1或EG2都同哮喘症状严重程度具有较好的正相关。除此以外，我们还分析了同一哮喘患者EG1和EG2的MFI及阳性百分比，表明两者间差异无显著性，这和Hed等^［4］报道的EG2更能反映气道的严重程度不一致，这是因为我们采血后是在室温下操作的，而没有在37℃孵育的原因。

　　综上所述，我们认为，EG1和EG2可能较血清ECP更特异，更灵敏地评价哮喘外周血EOS的活化及疾病的严重程度，可以作为判断哮喘气道炎症的一项临床观察指标。FOG-FITC-标记，经流式细胞仪测定EG1和EG2较免疫组织化学的方法更为可靠，有一定的推广和临床应用价值。

参考文献

　　1Tai PC, Peterson C, Venge P, et al. Monoclonal antibodies distinguish between storage and secreted forms of eosinophils cationic.Nature,1984,390:182-184.

　　2Womack MD, Kendall G, Mackconald RC. Detergent effects on enzyme activity and solubilzation of lipid bilayer membranes .Biochim,1983,733:210-215.

　　3Hallden G, Andersson U, Hed J.A new membrane perealilization method for the detection of intracellular antigens by flow cytometry .Journal of Immunological Method,1989,123:103-109.

　　4Hed J, Hallden G. Counts of activated blood eosinophils for monitoring asthma, Allery,1993,48:87-93.

　　5Jahnsen FL,Buandtzaeg A,Halstensen TS. Monoclonal antibody EG2 does not provide reliable immunohistochemical discrimination between resting and activate eosinophils. Journal of Immunological Methods, 1994,175:23-36.

(收稿：1998-02-18　　修回：1998-05-16)