哮喘豚鼠肺组织蛋白激酶的表达及其活化剂对血栓烷A₂释放的影响

中华结核和呼吸感染 1999年第4期第22卷 论著摘要

作者：吴奎　杨肇亨

单位：400042 重庆，第三军医大学大坪医院野战外科研究所呼吸内科

　　蛋白激酶C(PKC)是一个组织广泛分布的磷酸化酶，静息状态下定位于细胞胞浆中，受到刺激后，它可以转位至胞膜而活化，在细胞分泌、增生、分化等功能中发挥着重要作用^［1］。支气管哮喘是有多种炎性细胞参与的气道慢性炎症^［2］，炎性细胞释放多种炎性介质引起气道上皮损伤，神经末梢暴露，支气管平滑肌增生肥厚，对刺激的反应性增加，诱发气道高反应性。在以上过程中，PCK起着重要信号转导作用。哮喘时肺组织中多种炎性细胞PKC的表达及活化增加，但肺组织中PKC的活化及其作用的研究较少。我们采用卵蛋白(OVA)雾化吸入致敏和诱发豚鼠哮喘模型，于哮喘发作24小时后以放射性同位素标记方法测定哮喘豚鼠肺组织PKC活性的变化，测定PKC活化剂卟啉醇肉豆蔻(PMA)、抑制剂H-7对豚鼠肺组织炎性介质血栓烷A₂(TXA₂)释放的影响，并采用免疫组织化学方法，测定肺组织PKC表达及分布，以探讨PKC可能在哮喘发病过程中所起的作用，为寻求哮喘治疗的新途径提供一些可能有益的提示。

　　材料与方法　雄性豚鼠20只，体重250～300 g，随机分为对照组(C组)、哮喘组(A组)各10只。A组：参照Huston方法^［3］复制哮喘模型，诱发后24小时采集标本。C组：用0.9%生理盐水替代OVA致敏，诱发同A组。实验豚鼠麻醉后，开胸灌注生理盐水约200 ml，取左下肺置于4%多聚甲醛-PBS缓冲液固定，修整、石蜡包埋，切片。右肺4℃剪切成1 mm×1 mm大小，进行PKC提取及TXA₂的测定。PKC活性的测定参照^［4］进行。剪碎的肺组织每只动物称取0.25 g×3次，放入装有台氏液3只试管中，其中A管中含有100 ng·ml^-1H-7，37℃孵育5分钟，A、B两管加PMA至10 ng·ml^-1，三管同时37℃孵育30分钟，吸取上清，根据试剂盒说明书进行放射免疫测定。PKC免疫组织化学参照文献^［5］进行。判断标准：每张切片随机取染色区域四个高倍视野(×400)染色强度用0～3级计分：0级：无染色、1级：轻度阳性染色、2级：中度阳性染色、3级：强阳性染色；染色范围分为0～4级：0级：无染色、1级：＜25%细胞染色、2级：25%～50%细胞染色、3级：50%～75%细胞染色、4级：＞75%细胞染色。染色总评分为染色强度+染色范围。

　　数据统计分析：采用非配对t检验和直线相关分析。

　　结果　A组总PKC活性为［(466±111) fmol·mg^-1.min］，明显高于对照组［(102±14) fmol·mg^-1.min^-1］，两组比较差异有显著性(P＜0.01)，膜PKC活性及所占比例为(156±41)、(33±4)，与对照组(27±6、26±4)比较(P＜0.01，P＜0.05)。免疫组化显示，哮喘时见较广泛阳性染色细胞，分布于支气管粘膜、气管平滑肌(图1)、肺泡间、甚至肺泡腔内(图2)半定量计分表明，哮喘组(4.7±0.6)与对照组(1.7±0.5)比较(P＜0.01)。PMA引起TXA₂释放［(392±52) pg·ml^-1］、［(229±53) pg·ml^-1］与H-7［(63±14) pg·ml^-1］，［(34±5) pg·ml^-1］比较(P＜0.01)；H-7和未用药豚鼠(61±20，34±5)比较差异无显著性(P＞0.05)。相关分析表明，PKC活性与PMA诱导的TXA₂释放量呈显著正相关(γ=0.702，P＜0.01)。

图1　哮喘豚鼠肺组织，肺泡内大量炎性细胞浸润，

　　PKC呈阳性表达　DAB染色，苏木素复染　×400

图2　哮喘豚鼠支气管腔EOS浸润，浸润细胞及支气管粘膜、

　　气道平滑肌PKC呈强阳性表达　DAB染色，苏木素复染　×400

　　讨论　在哮喘发病过程中，炎性细胞出现了PKC活性以及分布比例的变化。哮喘患者淋巴细胞^［6］总PKC活性、膜PKC活性比例显著增加，患者肺功能与总PKC活性呈显著负相关；血和BALF低密度嗜酸细胞^［7］PKC活性显著增加。本组研究结果表明，哮喘豚鼠肺组织PKC呈强阳性表达，总PCK活性、膜PKC活性及所占比例显著增高，提示哮喘时PKC含量增加及活化，PMA是PKC高效活化剂，H-7是其特异性抑制剂，PMA引起肺组织释放TXA₂增加，用H-7预处理后，PMA未引起TXA₂的释放。相关分析表明PKC活性与TXA₂的释放量呈显著正相关，说明是PKC的活化引起了TXA₂的释放增加。其机制可能是促使TXA₂合成增加，因为TXA₂的半衰期极短，生成后迅速代谢为TXB₂而灭活。PKC活化可引起cPLA₂^［8］、COX^［9］活性增加，它们是合成TXA₂的关键酶。本组实验表明，在哮喘豚鼠肺级织中，细胞PKC表达增加，伴PKC的转位活化；PKC的活化引起炎性介质的释放，提示PKC在哮喘中起着重要作用，抑制PKC的活化或表达可能有利于哮喘的治疗。

　　参考文献

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(收稿：1998-09-17　修回：1998-12-05)