哮喘豚鼠肺组织中嗜酸细胞凋亡与白细胞介素5 mRNA表达的相关性

中华结核和呼吸感染 1999年第4期第22卷 论　著

作者：毕玉田　杨肇亨　王长征

单位：毕玉田、杨肇亨(400042 重庆，第三军医大学大坪医院呼吸科)；王长征(第三军医大学新桥医院呼吸病研究所)

　　关键词： 哮喘；凋亡；嗜酸性粒细胞；白细胞介素5

　　【摘要】　目的　探讨哮喘时嗜酸细胞(EOS)凋亡与肺组织白细胞介素5(IL-5) mRNA表达的关系。方法　将豚鼠随机分为对照组(正常组7只)、哮喘组(8只)、地塞米松组(8只)，应用脱氧核糖核酸末端转移酶介导的缺口末端标记(TUNEL)技术和原位杂交方法，检测支气管肺泡灌洗液(BALF)中不同密度EOS凋亡百分比和肺组织IL-5 mRNA的表达。结果　(1)正常对照组BALF中低密度EOS(HEo)、正常密度EOS(NEo)凋亡百分比分别为(29.86±10.09)%和(28.57±7.20)%，哮喘组分别为(19.57±8.60)%和(20.71±7.16)%，两组比较差异均有显著性(P＜0.05)；肺组织中IL-5 mRNA原位表达水平(面密度10^-3)正常对照组为7.86±2.48，哮喘组为27.18±13.80，两组比较差异有显著性(P＜0.01)；(2)地塞米松预防用药后HEo、NEo凋亡百分比分别为(63.75±13.69)%和(86.38±10.94)%，IL-5 mRNA表达水平为8.73±3.98，与哮喘组比较差异均有显著性(P＜0.01)；(3)IL-5 mRNA表达水平与HEo凋亡百分比呈显著负相关(r=-0.491，P＜0.05)、与NEo凋亡百分比呈显著负相关(r=-0.492，P＜0.05)。结论　哮喘豚鼠肺组织IL-5 mRNA表达的增加与BALF中EOS的凋亡百分比减少密切相关。抑制IL-5 mRNA表达、促进EOS的凋亡可能是糖皮质激素减少EOS浸润及治疗支气管哮喘的重要机制之一。

Correlation of eosinophil apoptosis with interleukin 5 mRNA expression in lung tissues of asthmatic guinea pigs

　　【Abstract】　Objective　To explore the correlation of interleukin 5 mRNA expression with eosinophil apoptosis in lung tissues of asthmatic guinea pigs.Methods　Guinea pigs were divided into asthma, asthma pretreated with dexamethasone and control groups. Guinea pigs were sensitized by exposure to aerosolized ovalbumin.Twenty four hours after the animals were challenged by aerosolized ovalbumin,the apoptosis percentages of hypodense eosinophils(HEo) and normodense eosinophils(NEo) in bronchoalveolar lavage fluid (BALF), and IL-5 mRNA expression in lung tissues were detected with terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP nick end labeling (TUNEL) technique and in situ hybridization.Results　(1)In the asthmatic group, the percentages of HEo and NEo apoptosis were significantly decreased (P＜0.05),and IL-5 mRNA expression was significantly increased as compared with the control (P＜0.01). (2) In the group pretreated with dexamethasone, the apoptosis percentages of HEo and NEo were significantly increased (P＜0.01), and IL-5 mRNA expression was reduced as compared with the asthmatic group (P＜0.01). (3) IL-5 mRNA expression was negatively correlated with apoptosis percentage of HEo (r=-0.491, P＜0.05) and NEo (r=-0.492, P＜0.05).Conclusions　IL-5 mRNA expression in lung tissues closely correlated with apoptosis percentage of Eos in BALF. Inhibiting the expression of IL-5 mRNA and promoting the apoptosis of Eos in lung tissues may be one of the important mechanisms of glucocorticoids to reduce infiltration of Eos in lung tissues and their therapeutic effect in asthma.

　　【Key words】　Asthma　　Apoptosis　　Eosinophil　　Interleukin 5

　　支气管哮喘是一种以嗜酸细胞(EOS)、肥大细胞反应为主的气道慢性炎症^［1］。阐明EOS增多的机制对哮喘的防治有重要的理论和实践意义。既往研究主要集中在骨髓产生的EOS增多，近年来Simon等^［2］认为EOS凋亡受抑制可能是EOS增多的重要原因。白细胞介素5(IL-5)主要由Th₂类淋巴细胞产生的特异作用于EOS的细胞因子，被认为是抑制EOS凋亡的细胞因子^［3］。我们的研究采用卵蛋白吸入诱发豚鼠哮喘模型，应用脱氧核糖核酸末端转移酶介导的缺口末端标记(TUNEL)技术和原位杂交方法，检测不同密度EOS凋亡比例改变和肺组织IL-5 mRNA表达，以探讨哮喘豚鼠肺组织EOS凋亡规律，以及地塞米松对其凋亡的影响，为临床治疗哮喘提供新的理论依据。

　　材料与方法

　　一、哮喘动物模型的制作及药物防治

　　23只豚鼠(第三军医大学动物所提供)，雌雄不限，体重300～400 g，随机分为正常对照组(C组，7只)、哮喘组(A组，8只)、地塞米松治疗组(D组，8只)。A组：参照Hutson方法^［4］，复制哮喘模型，诱发后24小时采集标本。C组：用0.9%生理盐水替代OA致敏，诱发同A组。D组：致敏和诱发同A组，在诱发前6天用0.5 mg·kg^-1.d^-1地塞米松腹腔注射。连续6天，诱发前12小时停药。

　　二、标本采集

　　原位杂交组织切片制作及支气管肺泡灌洗液(BALF)的获取按常规方法进行。

　　1.嗜酸细胞涂片的制备：制成密度为1.090 kg/L和1.080 kg/L的Percoll液，各2 ml先后加入15 ml锥形玻璃试管，然后轻轻沿管壁加BALF于其上，2 000 r/min离心20分钟后，收集中间层及沉淀细胞，EOS纯度达95%以上，细胞活力(台盼蓝染色检查)＞95%。将中间层及沉淀细胞分别手工涂片，于显微镜下监视细胞密度。涂片于37℃烘烤5分钟后用150 mg/ml多聚甲醛和1.5%体积分数为0.015的戊二醛固定10分钟，再用PBS洗涤2次，65℃烤40分钟，然后浸入75%乙醇中-20℃保存备用。

　　2.电镜标本制备：部分BALF离心后去上清，细胞以3%戊二醛固定后行电镜检查。

　　三、探针的制备及标记

　　按常规行豚鼠IL-5 cDNA质粒pSP6K-mTRF23(日本Akira Tominaga教授惠赠）的转化、扩增、抽提和纯化，BamH1酶切、目的片段回收，片段约1.5 kb。按德国宝灵曼公司试剂盒说明，用地高辛配基随机引物法标记IL-5 cDNA探针。

　　四、原位杂交

　　参照文献［5］进行，略有改进。(1)阴性对照：肺组织切片预先经RNA酶处理后再行原位杂交。(2)图像分析：每一玻片任选5个视野，自动检测阳性细胞面密度，取其平均值，进行统计分析。

　　五、BALF中EOS凋亡的检测

　　细胞凋亡检测试剂盒(POD)购自德国宝灵曼公司，参照说明按以下步骤进行。取出-20℃，75%乙醇中保存的标本，自然风干。PBS漂洗2分钟。用含0.3% H₂O₂的甲醇100 μl，室温30分钟，以封闭内源性过氧化物酶活性。PBS漂洗2分钟。加通透液100 μl(0.1% Triton-X100溶于0.1%柠檬酸纳)4℃，2分钟。PBS漂洗2次，每次2分钟，再吸干标本周围(勿使标本干燥)。加15 μl TUNEL反应混合液，加盖片37℃ 60分钟。PBS漂洗3次，每次2分钟。加15 μl 过氧化物酶连接的抗荧光素抗体，加盖片37℃ 30分钟。PBS漂洗3次，每次2分钟。加50 μl DAB溶液，室温黑暗10分钟。PBS洗，终止反应，脱水、透明、封片。显微镜观察,计数200个细胞,测出阳性细胞所占百分比。

　　六、统计学处理

　　实验数据用±s表示。组间比较及相关分析全部用非配对计量资料检验和直线相关分析。

　　结　果

　　一、实验动物肺组织IL-5 mRNA的表达水平

　　原位杂交结果镜下显示,哮喘时肺组织见较广泛阳性染色细胞，主要分布于气管粘膜下、肺泡间、甚至肺泡腔内。而地塞米松组与正常对照组实验动物肺组织可见少许阳性染色细胞。图像分析显示，肺组织IL-5 mRNA水平(面密度10^-3)哮喘组［(27.18±13.8)×10^-3］明显高于对照组［(7.86±2.48)×10^-3］和地塞米松组［(8.73±3.98)×10^-3］(P＜0.01)，而地塞米松组IL-5 mRNA水平与对照组比较差异无显著性(P＞0.05)。

　　二、实验动物BALF中EOS凋亡检测

　　将三组动物所得BALF中的低密度(HEo) 、正常密度(NEo)行凋亡检测,结果显示：地塞米松组无论HEo和NEo凋亡百分比均较对照组和哮喘组显著增高，且NEo的凋亡百分比显著高于HEo凋亡百分比；哮喘组HEo和NEo凋亡百分比均较对照组显著降低(P＜0.05，表1)。

表1　三组豚鼠不同密度EOS凋亡百分比分析(±s)

　　注：与正常组比较^*P＜0.05，^**P＜0.01；与哮喘组比较，^▲P＜0.01；正常密度与低密度EOS比较，^＃P＜0.01

　　三、肺组织IL-5 mRNA表达水平与EOS凋亡的相关分析

　　相关分析表明，IL-5 mRNA水平与HEo呈显著负相关(r=-0.491,P＜0.05)，与NEo凋亡百分比也呈显著负相关(r=-0.492,P＜0.05)。

　　四、BALF中EOS凋亡的电镜观察

　　电镜下可见EOS核固缩、染色质边集、核膜破裂等早期凋亡改变乃至凋亡小体形成(图1～4)。

图1　EOS出现核固缩、染色质凝聚　电镜　×10 000

图2　EOS出现核染色质凝集在核周边，形成环状改变　电镜　×12 000

图3　EOS呈凋亡状态，染色质凝集、靠边，呈块状分布，核中央部分染色质稀疏，形成空白区，核膜破溃，核内容物和胞浆相互融合　电镜　×10 000

图4　EOS细胞核固缩呈团状形成凋亡小体　电镜　×10 000

　　讨　论

　　哮喘时伴有EOS在气道内浸润、聚集，如何使其被清除于体外尚不清楚。IL-5被认为是调节EOS功能的最重要的细胞因子，在其众多功能中，IL-5通过阻止EOS发生凋亡而延长其存活引起人们重视。大量体外研究表明，IL-5可阻止EOS发生细胞凋亡^{［3，6-8］}。Yamaguchi等^［3］报道，IL-5介导的EOS存活与IL-5诱导的蛋白合成有关。Woolley等^［9］为研究气道内EOS的清除机制，采集11例患者在哮喘急性发作期及皮质类固醇治疗2周后的痰液标本，观察其中EOS的凋亡。研究结果显示，气道内EOS总量及活化细胞百分比明显下降，凋亡的EOS比率明显增加，并在巨噬细胞中可见到EOS产物，认为EOS凋亡有利于哮喘过程中EOS炎症的消退，从而使临床症状改善，认为糖皮质激素可调节EOS凋亡，其机制可能是通过抑制具有延迟凋亡作用的细胞因子而实现的。

　　本组研究结果显示，地塞米松治疗组肺组织IL-5 mRNA表达明显低于哮喘组,与正常组比较差异无显著性，且无论HEo或NEo 凋亡百分比均较哮喘组和对照组明显增高，凋亡百分比与IL-5 mRNA呈显著负相关。提示地塞米松通过抑制IL-5 mRNA的表达可能促进了EOS凋亡。

　　本组实验发现，地塞米松组与对照组比较，肺组织IL-5 mRNA表达水平相当，但地塞米松组BALF中，无论HEo或NEo，其凋亡百分比均显著高于对照组。提示地塞米松促进EOS凋亡除了通过下调IL-5途径，还有其它途径存在。地塞米松是否直接通过糖皮质激素受体介导凋亡信号途径而促进EOS凋亡，有待进一步研究阐明。Druilhe等实验发现地塞米松对Fas抗原的表达并无影响，但促进抗Fas单抗诱导的EOS凋亡^［10］，证实地塞米松可增强EOS凋亡的敏感性。此外，本组实验中哮喘组肺组织IL-5 mRNA表达较对照组、地塞米松组显著增加(P＜0.01)，但哮喘组EOS凋亡与正常组比较P值仅＜0.05，提示哮喘组EOS凋亡并未因IL-5明显增高而显著受抑，进一步表明地塞米松促EOS凋亡作用是通过增强EOS凋亡敏感性和抑制IL-5等促EOS存活因子的产生多种途径实现的。

　　本组研究对不同密度EOS凋亡进行了比较，发现地塞米松治疗组NEo显著高于NEo，提示地塞米松对不同密度EOS凋亡的影响存在差异。这可能是糖皮质激素治疗哮喘后HEo减少的一种解释，即糖皮质激素抑制了IL-5的产生，促进了NEo凋亡，避免了体内高IL-5水平下NEo向HEo的转化，且控制了机体EOS总数，维持了机体正常生理过程。

　　参考文献

　　1　中华医学会呼吸病学分会哮喘学组. 支气管哮喘防治指南（支气管哮喘的定义、诊断、治疗、疗效判断标准及教育和管理方案).中华结核和呼吸杂志,1997,20:261-265.

　　2　Simon HU, Blaser K. Inhibition of programmed eosinophil death: a key pathogenic event for eosinophilia? Immunol Today, 1995,16:53-55.

　　3　Yamaguchi Y, Suda T, Tominaga K, et al. Analysis of the survival of mature human eosinophils: interleukin-5 prevents apoptosis in mature human eosinophils. Blood, 1991,78:2542-2547.

　　4　Huston PA,Church MK,Clay TP, et al.Early and latephase bronchoconstriction after allergic challenge of nonanesthetized guinea pigs. The association of disordered airway physiology to leukocyte infiltration. Am Rev Respir Dis, 1988,137:548-557.

　　5　蔡文琴，王伯云，主编.实用免疫细胞化学与核酸分子杂交技术. 成都.四川科学技术出版社, 1994.406-434.

　　6　Stern M, Meagher L, Savill J, et al. Apoptosis in human eosinophils programmed cell death in eosinophil leads to phagocytosis by macrophages and is modulated by IL-5. J Immunol, 1992,148:3543-3549.

　　7　Her E, Frazer J, Auster KF, et al. Eosinophil hematopoietins antagonize the programmed cell death of eosinophils: cytokine and glucocorticoid effects on eosinophils maintained by endothelial cell-conditioned medium. J Clin Invest, 1991,88:1982-1987.

　　8　Suzuki S, Okubo M, Kaise S, et al. Gold sodium thiomalate selectively inhibits interleukin-5-mediated eosinophil survival. J Allergy Clin Immunol, 1995,96:251-256.

　　9　Woolley KL, Gibson PG, Wilson AJ, et al. Eosinophil apoptosis and the resolution of airway inflammation in asthma. Am J Respir Crit Care Med, 1996,154:237-243.

　　10　Druilhe A, Cai ZZ, Pretolani M, et al. Fas-mediated apoptosis in cultured human eosinophils. Blood, 1996,87:2282-2290.

(收稿：1998-09-31　修回：1998-11-16)