大鼠哮喘模型气道蛋白激酶C表达的研究
中华结核和呼吸感染 1999年第9期第22卷 论著摘要
作者：金毅 徐永健 张珍祥
单位：430030 武汉，同济医科大学附属同济医院呼吸内科(金毅、徐永健、张珍祥)
观察大鼠哮喘模型气道蛋白激酶C（PKC）表达的变化，为探讨PKC在哮喘发病机制中的作用提供实验资料。
材料与方法 （1）大鼠哮喘模型的建立：参照吕国平等［1］报道的方法，哮喘组大鼠每只腹腔内注射抗原液1 m1致敏，2周后用超声雾化喷雾1%鸡卵清蛋白（OVA）让大鼠吸入20分钟激发哮喘，对照组腹腔内注射0.9%生理盐水1 m1。（2）分组：SD雄性大鼠（同济医科大学实验动物中心提供）28只，体重150～250 g，随机分为4组，每组7只。A组（正常对照组）：喷雾生理盐水20分钟，每日1次，共2周。B组(即刻激发组):喷雾1% OVA让大鼠吸入20分钟激发哮喘。C组(哮喘发作1周组):喷雾1% OVA 20分钟，每日1次，共1周。D组(哮喘发作2周组):喷雾1% OVA 20分钟，每日1次，共2周。(3)组织标本制作:于实验的第14日（B组）、21日（C组）、28日（D组）经1% OVA喷雾20分钟激发后，按李荣等［2］方法测定肺功能，包括潮气量（VT），气道阻力（Raw）。A组于实验的第28日经0.9%生理盐水喷雾20分钟后测肺功能。随即经气管插管取支气管肺泡灌洗液（BALF）作细胞学分类。开胸取右肺中叶及气管条10 mm，部分常规病埋切片，余部分10%福尔马林固定，石蜡包埋切片，用于链霉亲合素-生物素（SP）法。（4）免疫组织化学染色：选用免疫组织化学染色SP法，抗体选用美国Sigma公司兔抗PKC α、PKC β1（1∶10），生物素化单抗兔IgG(1∶10)酶标S-P（1∶100）。
计算机图像分析：采用MPIAS-500型分析仪测定大鼠气道上皮及平滑肌PKC阳性表达的积分光密度。随机测定10个高倍视野后计算其均值，作为该切片的代表值。
统计学处理：全部数据均经SAS统计软件进行分析，计算其
±s，各组间差异的显著性用t检验。两变量的相关程度用直线相关法分析。
结果 (1)大鼠致敏激发后肺功能的改变见表1。(2)BALF细胞学分类见表2。(3)致敏哮喘大鼠模型肺组织HE染色可见细支气管腔内充满粘液性炎细胞，细支气管上皮变性，细胞脱落，粘膜及粘膜下以淋巴细胞、嗜酸细胞为主的炎性细胞浸润。我们选用抗PKC α、PKC β1两种同功酶的抗体作为第一抗体。结果发现，α同功酶主要分布于气管至终末细支气管的气道上皮（图1），与Larviee等［3］的研究结果相吻合；与对照组相似，哮喘组（B、C、D组）α同功酶主要在气道上皮层表达（图2～4），但PKC表达明显增强。β1同功酶则主要在气管至终末细支气管的气道平滑肌层表达（图5），与Donnelly等［4］的研究结果相符；与对照组相似，哮喘组（B、C、D组）β1同功酶主要在气道平滑肌层表达（图6～8），但PKC表达明显增强。定量分析结果见表3。(4)肺功能改变与PKC表达之间的相关分析表明，随气道阻力升高，气道上皮PKC α表达呈上升趋势，两者呈正相关（r=0.58，P＜0.05），气道平滑肌PKC β1表达亦呈正相关（r=0.66，P＜0.01）。
1 正常对照组大鼠肺组织气道上皮PKC 少量表达免疫组化组 ×400
2 哮喘即刻激发组大鼠肺组织气道上皮PKC 表达较对照组增强 免疫组化 ×400
3哮喘发作1周组大鼠肺组织气道上皮PKC 表达较对照组明显增强 免疫组化 ×400
4 哮2周组大鼠肺组织气道上皮PKC 表达较对照组明显增强 免疫组化 ×400
5 正常对照组大鼠肺组织气道平滑肌PKC 少量表达 免疫组化 ×100
6 哮喘即刻激发组大鼠肺组织气道平滑肌 PKC表达较对照组增强 免疫组化 ×100
7 哮喘发作1周组大鼠肺组织气道平滑肌PKC 表达较对照组增强 免疫组化 ×100
8 哮喘发作2周组大鼠肺组织气道平滑肌PKC 表达较对照组增强 免疫组化 ×100
表1 四组大鼠哮喘模型肺功能变化(±s)
| 组别 |
只数 |
潮气量(ml) |
气道阻力(cm H2O。s-1。ml-1) |
| A组 |
7 |
2.66±0.56 |
0.8±0.3 |
| B组 |
7 |
1.69±0.22▲ |
2.4±0.8* |
| C组 |
7 |
1.21±0.41* |
2.7±0.8* |
| D组 |
7 |
0.82±0.29* |
3.0±0.7* |
注：与A组比较▲P＜0.05，*P＜0.01
表2 四组大鼠支气管肺泡灌洗液中的细胞分类(±s)
| 组别 |
只数 |
细胞分类 |
| 巨噬细胞 |
嗜酸细胞 |
淋巴细胞 |
| A组 |
7 |
0.90±0.04 |
0.0460±0.0017 |
0.09±0.04 |
| B组 |
7 |
0.70±0.06* |
0.1526±0.0376* |
0.14±0.04* |
| C组 |
7 |
0.67±0.06* |
0.1685±0.0359* |
0.16±0.04* |
| D组 |
7 |
0.69±0.06* |
0.1557±0.0225* |
0.16±0.06* |
注：与A组比较P＜0.01
表3 各组蛋白激酶C表达量比较(A值，±s)
| 组别 |
只数 |
气道平滑肌(PKC β1) |
气道上皮(PKC α) |
| A组 |
7 |
0.26±0.09 |
0.32±0.11 |
| B组 |
7 |
0.99±0.24* |
0.80±0.16△ |
| C组 |
7 |
1.32±0.22*▲ |
2.29±0.38*▲ |
| D组 |
7 |
1.41±0.17*▲ |
2.51±0.41*▲ |
注：与A组比较△P＜0.05，P＜0.01；与B组比较▲P＜0.01 讨论 PKC有10种同功酶，不同的同功酶可能有一定的功能特异性［5］。蛋白激酶C信息通道在支气管哮喘发病的多个环节中起着重要的介导作用，它活化后可导致支气管平滑肌收缩，促进肥大细胞、嗜碱细胞和血小板释放各种炎性介质，促进气道粘液分泌，使气道平滑肌增生［6］。本组研究发现，哮喘组PKC表达较对照组明显增高，差异有显著性。随着激发的持续呈上升的趋势，并且随气道阻力升高气道平滑肌PKC表达量亦升高。提示PKC参与了哮喘气道阻力增高、气流受限的发病过程。
近年的研究表明，气道上皮细胞（EC）作为效应细胞合成释放炎症介质和细胞因子、分泌粘液及表达粘附分子参与哮喘病理生理过程。Krunkosky等［7］发现抗原诱导的气道上皮粘附分子1（ICAM-1）的表达依赖于PKC的激活，而Kai等［8］发现，PKC活化参与气道上皮细胞分泌HMWG，说明气道上皮PKC激活参与了哮喘的病理生理过程。而我们的研究发现，哮喘组大鼠气道上皮PKC表达量较正常组明显升高，且随气道阻力升高，气道上皮PKC表达量亦升高，呈正相关。本组研究结果进一步提示，PKC参与了哮喘气道阻力增高，气流受限的发病过程，参与了哮喘的病理生理过程。
参考文献
1 吕国平, 崔德健, 郭英江,等. 介绍一种建立大鼠哮喘模型的实验方法. 中华结核和呼吸杂志, 1995, 18: 377.
2 李荣, 张珍祥. 一氧化氮对实验性哮喘的作用. 中国病理生理杂志, 1997, 13: 201-202.
3 Larviee P, Lerine ST, Martinez A. Platelet-activating factor induces airway mucin release via activation of protein kinase C: evidence for translocation of protein kinase C to membranes. Am J Respir Cell Mol Biol, 1994, 11: 199-205.
4 Donnelly R, Yang K, Omary MB. Expression of multiple isoenzymes of protein kinase C in airway smooth muscle. Am J Respir Cell Mol Biol, 1995, 13: 253-256.
5 Otte AP, Moon RT. Protein kinase C isozymes have distinct roles in neural induction and competence in xenopus. Cell, 1992, 68: 1021-1029.
6 徐永健, 张珍祥. 蛋白激酶C信息通道在支气管哮喘发病机制中的作用. 国外医学呼吸分册, 1996, 16: 67-70.
7 Krunkosky TM, Fischer BM, Alkey BJ. Tumor necrosis factor alpha (TNF alpha)-induced ICAM-1 surface expression in airway epithellial cells in vitro: possible signal transduction mechanisms. Ann Ny Acad Sci, 1996, 31: 796: 30-37.
8 Kai H, Yoshitake Ki, Isohama Y. Involvement of protein kinase C in mucus secretion by hamster tracheal epithelial cells in cuture. Am J Physiol， 1994, 267: 526-530.
收稿：1998-12-11
修回：1999-04-15
用户登录 
新用户注册