慢性阻塞性肺疾病和哮喘患者痰中降钙素基因相关肽的变化

中华结核和呼吸感染 1999年第9期第22卷 论著

作者：许晖　赵鸣武　王宪

单位：100083 北京医科大学第三医院呼吸科(许晖、赵鸣武)；血管医学研究所(王宪)

　　关键词： 降钙素基因相关肽；肺疾病，阻塞性；哮喘

　　【摘要】　目的　探讨慢性阻塞性肺疾病(COPD)和支气管哮喘患者气道分泌物中，感觉神经肽降钙素基因相关肽(CGRP)释放在气道慢性炎症性疾病发病中的作用。方法　选择稳定期COPD患者19例、支气管哮喘患者14例、正常对照组10名，通过面罩吸入超声雾化的4%高张盐水诱导痰液，将获得的诱导痰涂片进行瑞氏-姬姆萨染色计数细胞成分的变化，用放射免疫方法测定诱导痰中CGRP免疫反应性物质(CGRP-LI)的含量改变，并进行CGRP-LI与一秒钟用力呼气容积(FEV₁)的相关性分析。结果　诱导痰中CGRP-LI含量在COPD组为(15.97±2.15)ng/L，支气管哮喘组为(18.79±3.91)ng/L，与正常对照组(2.36±0.35)ng/L比较，差异有显著性(P＜0.05)，而且与FEV₁呈显著负相关(r=-0.50和-0.61, P均＜0.05)。COPD患者诱导痰中中性粒细胞百分比为(64.9±2.9)%,与支气管哮喘患者(26.5±1.5)%和正常对照组(25.9±2.6)%比较，差异有显著性(P＜0.01)；支气管哮喘患者诱导痰中嗜酸细胞百分比为(5.80±0.50)%，与COPD患者(1.00±0.20)%和正常对照组(0.80±0.10)%比较，差异有显著性(P＜0.01)。结论　CGRP释放增多可能参与气道慢性炎症的发病。

Changes of calcitonin gene-related peptide content in induced sputum from patients with COPD and asthma

XU Hui, ZHAO Mingwu, WANG Xian.

Third Hospital of Beijing Medical University, Beijing 100083

　　【Abstract】　Objective　To explore the role of sensory neuropeptide calcitonin gene-related peptide (CGRP) in the pathogenesis of chronic airway inflammatory diseases COPD and bronchial asthma. MethodsPatients with COPD (n=19), bronchial asthma (n=14), all were in stable stage and 10 normal volunteers were examined. After hypertonic saline inhalation challenge in all subjects, CGRP-LI concentration in the induced sputum was measured by radioimmunoassay. Cellular content was assayed by microscopic analysis, the relation between CGRP-LI level and FEV₁ value was calculated by liner regression. Results　The sputum CGRP concentrations in patients with COPD and patients with asthma were (15.97±2.15)ng/L, (18.79±3.91)ng/L, respectively, both were significantly higher than those in normal volunteers (2.36±0.35)ng/L. Moreover, CGRP concentrations in induced sputum in each disease group were correlated with the degree of airflow obstruction, r=-0.50 and -0.61, respectively （P＜0.05）. The percentage of neutrophil cell count (64.9±2.9)% was significantly higher in patients with COPD （P＜0.01）, while the percentage of eosinophil cell count (5.8±0.5)% was increased in patients with asthma （P＜0.01）. Conclusions　The data suggested that CGRP release may participate in the chronic inflammation of patients with COPD and bronchial asthma.

　　【Key words】　Calcitonin gene-related peptide　　Pulmonary disease, obstructive　　Asthma

　　慢性阻塞性肺疾病(COPD)和支气管哮喘是两种气道慢性炎症性疾病，它们在病理、细胞学以及临床特征等方面有许多相似之处。炎性介质和神经介质的大量释放在COPD和哮喘发病过程中可能具有重要作用^［1］。降钙素基因相关肽(CGRP)是一种感觉神经来源的神经肽，具有广泛的生物学效应。在呼吸系统中，CGRP与速激肽(TKs)共存于感觉神经末梢，并可通过无髓鞘的C纤维介导的轴突反射共同释放出来，增加气道粘膜血流，改变气道口径，加强P物质(SP)引起的血管通透性增加和血浆蛋白渗出，以上这些病理变化在慢性支气管炎等气道炎症反应中均可见到^［2］。根据上述CGRP的作用以及它参与感染中毒性休克等其它类型炎症性疾病的特点^［3］,我们推测CGRP可能在COPD和支气管哮喘的发病中也具有重要作用。

　　我们以往动物实验的工作表明，CGRP参与大鼠慢性支气管炎的病理生理过程。文献报道主要集中在研究支气管哮喘时CGRP的作用^［1］，多数结果显示，CGRP在支气管哮喘中具有重要的意义，而CGRP在COPD中的作用还鲜有报道。

　　我们对COPD和支气管哮喘患者进行诱导痰中CGRP免疫反应性物质(CGRP-LI)测定，研究在上述疾病状态下CGRP-LI释放的改变以及与病情严重程度的关系，以探讨CGRP在COPD和支气管哮喘发病中的作用。

　　对象与方法

　　一、研究对象

　　COPD组19例, 男14例，女5例，年龄49～75岁，平均年龄66±7岁，其中吸烟者11例，不吸烟者8例；支气管哮喘组14例, 男6例，女8例，年龄21～70岁，平均年龄42±16岁，其中吸烟者4例，不吸烟者10例；正常对照组10名, 男6名，女4名，年龄25～75岁，平均年龄52±15岁，其中吸烟者和不吸烟者各5名。所有病例均符合中华医学会呼吸病学分会制定的COPD和支气管哮喘诊断标准^［4，5］。所有患者均处于稳定期。各组的一秒钟用力呼气容积占预计值百分比（FEV₁占预计值%）的平均值分别为：COPD组(53±4)％、支气管哮喘组(64±5)％、正常对照组(96±5)％。

　　二、实验方法

　　1. 痰液采集：参照Pin等^［6］报道的方法并加以改进：受试者于试验前24小时停用所有支气管扩张剂，于试验前12小时禁用含咖啡因的食物和饮料。试验前15分钟吸入沙丁胺醇200 μg(英国葛兰素公司)，以预防吸入高张盐水可能引起的支气管痉挛。面罩吸入超声雾化(超声雾化治疗仪，北京亚都加湿器公司)的4％高张盐水15～30分钟直至痰量达到约1 ml。为防止混入唾液，采用肉眼和倒置显微镜观察的方法去除唾液。痰液经振荡混匀后取10 μl加入等量0.1%二硫代苏糖醇(DTT，美国Sigma公司)混匀，先进行细胞计数，然后涂片行瑞氏-姬姆萨染色，计数200个非上皮细胞进行细胞分类。向剩余的痰液中加入2倍体积的0.1%三氟乙酸(美国Sigma公司)溶液，用超声波粉碎机(JY350型，浙江三门超声波仪器厂)粉碎，以3 000 r/min离心20分钟，取上清过C18柱(美国半岛公司)，经冷冻离心机干燥后，冷冻于-40℃以待放射免疫测定，测定结果以每升痰液中CGRP-LI的量表示(ng/L)。

　　2. CGRP的放射免疫测定：采用我们以前报道的特异性放射免疫分析法^［3］，放射免疫缓冲液为0.1%牛血清白蛋白(BSA), 0.01%叠氮钠(NaN₃), 5 mmol/L NaCl, 0.1% TritonX-100的0.1 mmol/L的磷酸缓冲液(pH 7.4)。将大鼠CGRP标准品、样本与CGRP抗体在4℃孵育24小时，加入¹²⁵碘-降钙素基因相关肽(¹²⁵I-CGRP, 74 Bq/mol，中国科学院高能物理所)，再孵育24小时，加入羊抗兔IgG和正常兔血清，室温下反应120分钟，以分离游离和结合的同位素标记CGRP，最后每管放入0.5 ml缓冲液，在4℃ 3 000 r/min离心20分钟，弃除上清，用γ计数器(1470型，瑞士WALLAC公司)测定沉淀中的¹²⁵I放射性强度，再根据标准曲线计算出样本中CGRP的含量(大鼠CGRP、CGRP抗体、羊抗兔IgG、正常兔血清购自美国半岛公司，BSA、NaN₃、TritonX-100购自美国Sigma公司)。

　　三、统计学处理

　　实验结果均以±s来表示，进行多组结果比较时采用单因素方差分析，组间两两比较用Student-Neuman-Keuls检验，比较两组间结果时采用组间均数t检验，进行相关性研究采用线性回归分析，以P＜0.05为差异有显著性。

　　结果

　　一、三组患者的平均痰量

　　COPD组(1.5±0.3) ml、支气管哮喘组(1.3±0.4) ml及正常对照组(1.1±0.1) ml三组间比较差异无显著性(P＞0.05)。所有受试者痰中鳞状细胞数量均＜10％，说明样本来自下呼吸道。

　　二、各组诱导痰中CGRP-LI的水平

　　COPD组(15.97±2.15) ng/L、支气管哮喘组(18.79±3.91) ng/L与正常对照组(2.36±0.35) ng/L比较，差异有显著性(P＜0.05)，而在两疾病组间比较差异无显著性(P＞0.05，图1)。

　　三、疾病组诱导痰中CGRP-LI与FEV₁的关系

　　COPD患者诱导痰中CGRP-LI与他们的FEV₁占预计值%呈显著负相关(r=-0.50, P＜0.05)。在支气管哮喘患者相关性分析也得到了类似结果(r=-0.61, P＜0.05，图2)。

图1　高张盐水诱导痰中CGRP-LI水平的变化

图2　COPD组和支气管哮喘组高张盐水诱导痰中CGRP-LI水平

　　与FEV₁占预计值%的相关性分析

　　四、各组诱导痰中细胞分类的变化

　　COPD患者诱导痰中嗜中性粒细胞百分比为(64.9±2.9)%,较支气管哮喘患者(26.5±1.5)%和正常对照组(25.9±2.6)%均显著增加(P＜0.01)，而巨噬细胞百分比为(31.5±2.6)%,较支气管哮喘患者(65.9±1.3)%和正常对照组(71.2±2.8)%均显著降低(P＜0.01)。支气管哮喘患者嗜酸细胞百分比为(5.80±0.50)%,较COPD患者(1.00±0.20)%和正常对照组(0.80±0.10)%均显著增加(P＜0.01)。淋巴细胞百分比在三组间比较差异无显著性(P＞0.05，表1)。

表1　各受试组4%高张盐水诱导痰细胞分类(±)

　　注：与哮喘组和对照组比较^*P＜0.05；与COPD组和对照组比较^**P＜0.05

　　讨论

　　我们的实验发现，COPD组、支气管哮喘组患者在吸入高张盐水后，诱导痰中CGRP-LI含量显著升高，而且在这两个疾病组中，CGRP-LI水平与受试者气流阻塞程度呈显著正相关，提示感觉神经肽在COPD和支气管哮喘的气流阻塞中可能发挥一定的作用。由于气流阻塞是气道平滑肌收缩、粘液分泌和痰栓形成以及气道壁充血、水肿等多种因素综合作用的结果，而CGRP及其与之共存、共释放的感觉神经肽如速激肽均具有上述作用，我们推测CGRP等感觉神经肽共同参与上述疾病气流阻塞的发生和发展。

　　许多研究显示, 感觉神经肽CGRP参与哮喘和气道高反应的病理生理过程。Barnes^［1］报道，在许多动物特别是啮齿类动物以及人类，CGRP参与支气管哮喘的神经源性炎症，如气道平滑肌痉挛、腺体分泌等，更主要的是炎症的充血过程。但Howarth等^［7］的报道则不同，他们研究哮喘和非哮喘患者，在经纤维支气管镜活检获得的气道组织中CGRP-LI差异没有显著性。新近报道，在慢性缺氧刺激下，大鼠气道CGRP免疫反应性纤维显著增加^［8］。另一研究显示，暴露于二氧化氮(NO₂)气体后，豚鼠气道CGRP-LI释放显著增加^［9］。由于COPD和支气管哮喘患者都存在气道慢性炎症，而慢性缺氧、环境毒物如NO₂刺激等均可能参与COPD的发病过程，所以我们推测CGRP在COPD的发病过程中可能也具有重要作用。但目前这方面还鲜有报道，尤其是CGRP在COPD患者发病中的作用国内外尚少报道。

　　我们前一工作^［10］在慢性支气管炎大鼠模型的研究中显示，慢性支气管炎时CGRP释放明显增多，其机制可能与慢性支气管炎时释放的炎性介质如缓激肽(BK)、前列腺素(PGs)等以及参与慢性支气管炎形成的物质如尼古丁刺激CGRP释放有关。此外，CGRP有促进乙酰胆碱引起气道平滑肌痉挛等作用，提示CGRP可能参与慢性支气管炎的病理生理过程。这就为研究CGRP在人类COPD和支气管哮喘中的作用打下了基础。

　　COPD和支气管哮喘时CGRP-LI释放增加的可能机制如下：首先气道上皮脱落和破坏是COPD以及支气管哮喘的特征之一，而CGRP降解的主要降解酶如中性内肽酶，主要存在于气道上皮。CGRP降解过程受损可能是导致CGRP-LI升高的机制之一。其次，气道上皮破坏后，感觉神经末梢暴露，活化神经源性炎症传导通路，通过轴突反射等途径引起CGRP等神经肽释放^［1］。另外，慢性支气管炎、支气管哮喘患者支气管肺泡灌洗液(BALF)中，PGs、BK等炎性介质的含量明显升高^［11］，它们均可刺激感觉C纤维，引起CGRP的释放增加，我们以往动物实验的结果^［10］已证实了这一点。还有，慢性气道炎症本身可以导致一些结构的改变，如炎症部位释放的神经生长因子(NGF)使神经增殖并可引起神经递质的合成增加。

　　COPD时气道腔内以嗜中性粒细胞增多为主，嗜中性粒细胞在气道腔内聚集、活化在COPD进行性气流阻塞中发挥重要作用^［12］。而支气管哮喘是以嗜酸细胞增多为特征的炎症，本组得到的结果与以往一致。而此时患者气道CGRP释放均增加，提示CGRP释放增加可能与气道慢性炎症和过敏性疾患均有关。以上这些结果为进一步研究COPD和支气管哮喘的发病机制进而寻找新的、有效的治疗方法打下了一定的基础。本组结果还表明，应用吸入高张盐水诱导痰进行细胞学和生化等方面研究的方法是可靠、安全的。本课题受国家杰出青年科学基金资助(基金编号: 39425027)和国家教委博士点基金资助(基金编号: 96024047)

　　参考文献

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收稿：1998-12-30

　　修回：1999-04-02