血管紧张素转换酶基因多态性与支气管哮喘感性关系的研究

中华结核和呼吸感染 1999年第11期第22卷 论著

作者：高金明　林耀广　肖毅　徐凯峰　许文兵　马毅

单位：100730 中国协和医科大学中国医学科学院北京协和医院呼吸内科

　　关键词： 哮喘；血管紧张素转换酶；多态性

　　【摘要】　目的　探讨血管紧张素转换酶（ACE）基因插入（Insertion，I）与缺失（deletion，D）多态性与支气管哮喘易感性、肺功能间的关系。方法　采用聚合酶链反应（PCR）确定50例哮喘患者，7个哮喘家系所有个体以及50名正常健康对照者ACE的基因型；乙酰甲胆碱（Mch）激发试验测定气道的反应性；测定哮喘患者肺的通气功能［一秒钟用力呼气容积占预计值百分比（FEV₁占预计值%）,一秒钟用力呼气容积/用力肺活量（FEV₁/FVC）］。结果　ACE基因D纯合型在哮喘组及哮喘家系组的频率分别为46%、53%，在对照组为16%，两组比较差异有显著性（P＜0.05），相对危险度为4.98。携带D型纯合子的哮喘患者FEV₁占预计值%及FEV₁/FVC的值分别为57%、69%，携带非D型的哮喘患者其FEV₁占预计值%及FEV₁/FVC的值分别为74%、79%，两组比较差异具有显著性（P＜0.05）。结论提示ACE基因D型纯合子与哮喘的遗传易感性相关，另外DD基因可能与哮喘患者肺功能损害的程度有关。

Polymorphism of angiotensin-converting enzyme gene and susceptibility to asthma with familial aggregation

GAO Jinming, LIN Yaoguang, XIAO Yi, et al.

　　department of Respiratory Disease, Peking Union Medical College Hospital, CAMS& PUMC, Beijing 100730

　　【Abstract】　 Objective　Angiotensin-converting enzyme (ACE) plays a key role in the metabolism of angiotensin II (AT II) and inactivation of bradykinins and tachykinins, which are potent bronchial constrictors and mediators of inflammation asthma, and ACE is heavily expressed in the lungs. An insertion-deletion (D/I) polymorphism of ACE gene has been shown to be associated with levels of ACE. Whether or not the polymorphism of aCE gene is associated with asthma and bronchial responsiveness was investigated.Methods　A case-control study was carried out in50 asthmatics, 7 families with at least 2 asthmatic individuals, and 50 healthy subjects. The insertion/deletion (I/D) polymorphism of ACE gene was amplified by polymerase chain reaction (PCR). Methacholine broncho(Mch)-provocation and pulmonary function tests were performed in all asthmatics.Results　There was an higher gene frequency of DD genotype of ACE gene in asthmatic subjects and families individuals compared with healthy subjects (46% vs 16%, P＜0.05; odd ratio 4.98). Accordingly, the mean values of FEV₁% and FEV₁/FVC were higher in asthmatics carrying non-DD alleles than patients with DD genotype(74% vs 57%, P＜0.05; 79% vs 69%, P＜0.05, respectively).Conclusions　The results suggested that DD allele of ACE genotype was significantly involved in genetic susceptibility to asthma. DD genotype of ACE might be a risk factor for the degree of airway obstruction.

　　【Key words】　Asthma　　Angiotensin-converting enzyme　　Genetics polymorphism

　　支气管哮喘（简称哮喘）是一多基因病，其发病受遗传和环境两方面因素的影响^［1］。尽管遗传因素与哮喘发病间的关系尚未完全阐明，但目前认为哮喘的本质是气道的慢性非特异性炎症并表现为气道高反应性（BHR）。血管紧张素转换酶（ACE）高度表达于肺，其作用有两方面^［2］：第一，可使血管紧张素（AT）I转换为AT iI，AT II通过与气道平滑肌的作用参与哮喘的发病；第二，使某些哮喘的炎性介质如缓激肽、速激肽及P物质失活。

　　ACE基因位于第17号染色体长臂2区3带（17q23），其多态性靠近16内含子3′端一个287碱基（bp）Alu重复序列的插入（I）或缺失（D）。研究表明，ACE基因D/I多态性与血清ACE的水平有关，DD型ACE水平最高，DI型次之，Ⅱ型最低^［3］。我们的研究旨在探讨ACE基因多态性与哮喘的相关性。采用分子生物学聚合酶链反应(PCR)的方法探讨了ACE基因型在我国北京地区汉族哮喘、哮喘家系及健康对照者间的分布，同时还研究了ACE基因与哮喘患者肺功能间FEV₁占预计值%、一秒钟用力呼气容积/用力肺活量(FEV₁/FVC）］的关系。

　　对象与方法

　　一、对象

　　50例哮喘患者，男19例，女31例，年龄16～69岁，平均年龄39岁，病程8个月～30年，平均病程14年。其中30%（15/50）患过敏性鼻炎，均来自于我院门诊、急诊及病房，哮喘的诊断符合1993年的标准^［4］。所有患者均需完成以下内容的调查问卷及检查：包括过敏史；皮肤划痕试验是否阳性；哮喘的症状（胸闷、气短、喘息、咳嗽等）；TIgE及sIgE（户尘螨过敏原d₁）测定；肺功能、乙酰甲胆碱（Mch）支气管激发试验（若FEV₁≥70%）、舒张试验。并除外其它如肺部、心脏病。

　　7个家系50例哮喘患者中，每个家系至少有2例哮喘患者。家系成员32名中有23例哮喘患者，占72%，男13例，女19例。对13例患者进行了气道激发试验，有11例阳性。

　　50名健康对照组均为我院健康献血员、我院职工及体检者。男30名，女20名，平均年龄31岁。所有入选本组试验的个体均需排除心血管系统疾病（尤其是高血压）、肾脏疾病及结节病。

　　二、PCR法扩增ACE基因I/D型

　　1.引物：上游引物：5′CTGGAGACCACTCCCATC-CTTTCT3′；下游引物5′GATGTGGCCATCACATT-CGTCAGAT3′。

　　2.PCR反应体系：25 μl的反应体系包括上、下游引物各1 μl，模板DNA1 μg，4×dNTP 1 μl，5×缓冲液5 μl，2%二甲基亚砜1 μl，Taq聚合酶0.5 u，双蒸水15 μl。

　　3.反应条件：94℃预变性2分钟，94℃变性60秒，58℃退火90秒，72℃延伸60秒，共30个循环。完成30个循环后再58℃延伸5分钟。

　　4.PCR产物的鉴定：PCR产物在含0.5 ng/ml溴乙锭的2%琼脂糖凝胶中，100 v电压下电泳15～20分钟。紫外灯下观察结果，并与标准Marker进行比较。若PCR产物长度为190 bp则为缺失型；若PCR产物长度为490 bp则为插入型。有3种ACE基因型：缺失纯合子（DD型）仅表现为190 bp的带型；插入纯合型（Ⅱ型）仅表现为490 bp的带型；若为插入/缺失（I/D）杂合型则有上述两条带型。

　　三、统计学方法

　　哮喘组及对照组ACE基因频率的比较采用卡方检验及YATE′S校正公式；哮喘中DD纯合子及非DD型患者间肺通气功能损害的比较采用非配对t检验。P＜0.05为差异有显著性。

　　结果

　　一、临床资料

　　50例哮喘患者中，41例（82%）对屋尘螨过敏(即RAST阳性，下同)，17例(34%)对粉尘螨过敏，19例(38%)对霉菌过敏。对19例（38%）患者进行了支气管激发试验，有18例（36%）阳性，其他患者因FEV₁占预计值%低于70%未行该试验。所有患者均进行了舒张试验，皆为阳性。平均Mch吸入量为0.64μmol。50例哮喘患者ΔFEV₁%为68 %。23例患者TIgE升高(≥300 iU/L)，均值为578 IU/L。

　　二、ACE基因I/D在哮喘组和健康对照组间的分布

　　哮喘患者中I、D频率分别为0.39, 0.61；D/D、I/I、I/D频率分别为46%、24%、3%。在健康对照组中I、D的频率分别为0.58、0.42；D/D、I/I、I/D频率分别为16%、32%、52%（表1）。

　　三、D/D纯合型与哮喘患者肺功能损害间的关系

　　D/D型哮喘患者其FEV₁占预计值%（57±21）% 和FEV₁/FVC（69±13）%的数值明显低于非D/D型的哮喘患者（74±19）%、（79±10）%，两组比较差异有显著性，P值分别为0.032和0.029（表2）。

表1　二组患者ACE基因I/D的分布

　　注：哮喘组与健康对照组比较P＜ 0.05

表2　D/D纯合型与哮喘患者肺功能损害间的关系(±s)

　　四、ACE基因I/D多态性在哮喘家系成员的分布

　　7例先证者中5例（72%）为DD型；所有家系成员中17例（53%）为DD型，10例（31%）为ID型，5例（16%）为Ⅱ型（图1）。

表示先证者：涂黑表示哮喘患者；■为男性；●为女性表示死亡。

　　图1　ACE基因I/D多态性在哮喘家系成员的分布

　　讨论

　　遗传与环境因素的共同作用在哮喘发病过程中起重要作用。尽管ACE在AT转换过程及灭活缓激肽、P物质等气道炎性介质中起重要作用，但ACE基因与哮喘关系的研究尚少报道。我们的研究表明，DD纯合型在哮喘个体及哮喘家系的频率分别46%及53%，这一结果提示，ACE d/D型可能与哮喘的发病有关。与法国学者Bennessino等^［5］的结果一致。Bennessino等的研究还显示，DD纯合子与哮喘患者肺功能损害的程度无关。而我们的研究则表明，DD型哮喘患者的肺功能损害的程度较非DD型哮喘者为重，这一结果与哮喘患者携带DD型基因频率高相一致。Christianzen等^［6］报道，哮喘患者血浆及肺泡灌洗液中有高水平的缓激肽，与我们的结论不一致，但Bennessino等^［5］认为携带DD型基因的哮喘患者体内ACE水平在数量和程度上不能完全抵消体内缓激肽的水平，缓激肽为支气管收缩因子。Miller等^［7］研究表明，急性哮喘患者体内ATⅡ水平明显增加，而AT Ⅱ通过与气管平滑肌的直接作用及通过诱导支气管收缩因子如内皮素的释放这一间接作用，而参与了哮喘患者气道功能的损害^［7］。体外实验结果显示，ATⅡ有促进气道平滑肌的生长的作用^［8］。故Bennessino等认为携带DD型ACE基因的哮喘患者体内长期有ACE的高表达，ACE通过与气道平滑肌的作用，使气道平滑肌肥厚，进而影响了气道的反应性并使气道壁“重塑”^［9］，我们的结果也证实，DD型ACE基因与气道反应有关系。

　　我们的研究成果表明，ACE基因I/D多态性与哮喘的易感性相关，还可能与小气道的损害程度有关。因为我们所选病例数相对偏少，故需要更大规模的病例对照及家系研究以证实ACE基因在哮喘发病中的作用。

　　本课题受国家“九^.五”攻关基金资助(基金编号：96-906-02-04)

　　参考文献

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　　4　中华医学会呼吸病学分会哮喘学组.支气管哮喘的定义、诊断、严重度分级及疗效判断标准.中华结核和呼吸杂志, 1993, 16哮喘增刊:5-8.

　　5　Benessiano J, Crestani B, Mestari F, et al. High frequency of a deletion polymorphism of the angiotensin-converting enzyme gene in asthma. J Allergy Clin immunol, 1997, 99: 53-57.

　　6　Christianzen SC, Proud D, Cochrane CG. Detection of tissue kallikrein in the bronchoalveolar lavage fluid of asthmatics subjects. J Clin Invest, 1987,79: 188-197.

　　7　Miller EA, Angus RM, Hulks G, et al. Activity of the renin-angiotensin system in acute severe asthma and the effect of angiotension II on lung function. Throax, 1994, 49: 492-495.

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　　9　Campbell-Boswell M, Robertson AL. Effect of angiotensin II and vasopressin on human smooth muscle cells in votro. Exp Mol Pathol, 1981, 35:265-276.

(收稿：1999-01-26　　修回：1999-06-28)