小鼠哮喘模型中白细胞介素5等对嗜酸细胞凋亡的调控作用
中华结核和呼吸感染 2000年第7期第23卷 论著摘要
作者：刘春涛 王曾礼 梁宗安 雷松
单位：刘春涛 王曾礼 梁宗安（610041 成都，华西医科大学附属第一医院呼吸内科）；雷松（肿瘤治疗中心）
先前我们已证实在小鼠哮喘模型中白细胞介素5(IL-5)和IL-10分别上行和下行调节气道炎症，二者的动态平衡是决定嗜酸细胞（EOS）浸润与消散的重要因素［1］。我们的研究进一步动态观察哮喘动物模型气道炎症全过程的变化，旨在探讨炎症促进因子IL-5和炎症抑制因子IL-10对EOS凋亡的调节作用。
对象与方法 哮喘模型制作：10周龄BALB/c小鼠10只，雌雄不限，体重（10±2）g，由华西医科大学动物中心提供。所有动物随机分配为对照组（11只）、致敏激发（SC）组（77只）。SC组小鼠腹腔注射10%卵白蛋白（OVA）0.1 ml及10%氢氧化铝凝胶0.2 ml致敏。14 d后以1% OVA溶液超声雾化，通入雾化吸入箱5 min后放入小鼠继续雾化20 min激发。连续激发3 d。对照组小鼠在相同时间腹腔注射和雾化吸入等量生理盐水。
支气管肺泡灌洗（BAL）与细胞分离：对照组小鼠及末次激发后0、8、24、48、96 h、7、14 d的SC组小鼠进行BAL。在小鼠气管内分3次（0.7 ml、0.6 ml、0.5 ml）缓慢注入37℃、去钙、镁离子Hank平衡盐液，缓慢回吸，回收液（BALF）在1.35～1.55 ml为合格样本［平均（1.4±0.3）ml］。1 500 r/ min，离心10 min，上清液作细胞因子检测。细胞用1 ml Hank液重悬，在2 h内作凋亡检测。
BALF中IL-5、IL-10测定：采用小鼠IL-5、IL-10酶联免疫吸附（ELISA）检测试剂盒（美国ENDOGEN公司），按试剂盒说明书进行操作。
EOS的标记和凋亡检测：BALF加等量生理盐水稀释，离心洗涤，生理盐水重悬细胞，取70 μ孔径尼龙筛网过滤并低速离心，调整细胞浓度为106/ml，加入CD 49 d-FITC和CD15-PE各10 U，室温避光孵育15 min后，加入5 ml PBS缓冲液离心洗涤。将已标记双色单抗的细胞（EOS细胞）固定打孔。经以上步骤处理的细胞转入流式上机试管，加入1 ml红色（PI）工作液作DNA染色，15 min后上流式细胞仪检测。
统计学处理：各组间及不同时间采用样本均数t检验，不同指标的相互关系采用直线相关分析。
结果 BALF中IL-5、IL-10浓度见表1。
表1 两组小鼠BALF 中IL-5、IL-10浓度分析（
±s）
| 组别 |
鼠数 |
IL-5（pg/ml） |
P值△ |
IL-10（pg/ml） |
P值△ |
| 对照组 |
10 |
7.4± 3.1 |
|
11±4 |
| SC 0 h组 |
10 |
8.2± 2.4 |
＞0.05 |
12±3 |
＞0.05 |
| SC 8 h组 |
10 |
14.4± 3.8 |
＜0.001 |
18±5 |
＜0.01 |
| SC 24 h组 |
10 |
26.8± 5.5 |
＜0.001 |
11±9 |
＞0.05 |
| SC 48 h组 |
9 |
30.6±13.4 |
＜0.001 |
13±7 |
＞0.05 |
| SC 96 h组 |
10 |
27.5± 8.8 |
＜0.001 |
19±3 |
＜0.001 |
| SC 7 d组 |
10 |
12.4± 3.2 |
＜0.05 |
16±3 |
＜0.05 |
| SC 14 d组 |
8 |
6.4± 2.1 |
＞0.05 |
13±3 |
＞0.05 |
注：△与对照组比较
EOS凋亡率：SC组EOS凋亡率在8 h及7～14 d形成两个峰值，但仅7～14 d与对照组比较差异有显著性，其余时相凋亡率与正常对照组相似或略低，差异无显著性（P＞0.05），见表2。
表2 两组小鼠EOS凋亡率分析（±s）
| 组别 |
鼠数 |
凋亡率（%） |
P值△ |
| 对照组 |
10 |
3.1±1.6 |
| SC 0 h组 |
10 |
3.2±1.6 |
＞0.10 |
| SC 8 h组 |
10 |
4.6±1.7 |
＞0.10 |
| SC 24 h组 |
10 |
2.7±1.4 |
＞0.10 |
| SC 48 h组 |
9 |
2.9±1.3 |
＞0.10 |
| SC 96 h组 |
10 |
3.5±0.9 |
＞0.10 |
| SC 7 d组 |
10 |
5.2±2.0 |
＜0.05 |
| SC 14 d组 |
8 |
6.8±2.1 |
＜0.01 |
注：△与对照组比较
EOS凋亡率与IL-5、IL-10相关性：SC组各时相IL-5、IL-10浓度与相应时相EOS凋亡率作直线回归分析，未发现有相关关系。若以IL-10/IL-5比值与凋亡率作直线回归分析，则显示有正相关关系（r=0.74, P＜0.01），若从8 h开始分析，则相关更为密切（r=0.988,P＜0.001）。
讨论 EOS是哮喘气道局部主要的损伤性炎症细胞，我们在动态观察中发现EOS在诱喘后迅速出现于气道中，但在炎症的后期（96 h～14 d）数量逐渐减少。近年研究证实，除肺内募集减少、重新分布与坏死外，细胞凋亡可能是 EOS减少的另一种原因。我们的研究再次证实，哮喘气道浸润的EOS存在凋亡现象。有人认为哮喘气道局部凋亡-抗凋亡机制失调，EOS凋亡不足或延迟是EOS 大量浸润的成因之一［2］。如郭晓明等［3］报道，哮喘动物EOS凋亡率为（2.1±1.3）%，而对照组为（10.1±3.4）%，哮喘组EOS中凋亡抑制基因产物BCL-2的表达亦高于对照组。但我们的研究结果显示，哮喘组EOS凋亡率总体水平并不低于对照组，而在炎症初期与后期仅有所增高，即EOS浸润过程始终伴随有凋亡之现象，提示致喘诱因在启动炎症反应的同时，亦启动凋亡程序，可能为机体防止炎症损伤持续与扩大化的保护反应。本组研究测得EOS凋亡率在3%～7%之间，因凋亡的形成与被清除过程仅为数秒～数分钟，这一水平的凋亡率对EOS在气道中的数量亦会产生显著的影响，故我们认为EOS凋亡是炎症消退的重要途径之一。
凋亡在体内受死亡基因及其产物（配体-受体）和多种细胞因子的调节。Th2 细胞因子、IL-5、IL-3、粒-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）是主要的EOS生长支持因子，体外实验显示，培养中的EOS若剥夺上述因子，则迅速发生凋亡［4］。IL-10亦由Th2细胞分泌，但对Th1、 Th2多种细胞因子的合成具有阻遏活性，是重要的免疫-炎症反应下行调节因子，目前尚无IL-10直接诱发EOS凋亡的证据，因其对IL-4、IL-5、GM-CSF有强烈的合成抑制作用，推测应为一种凋亡促进因子。本组实验未在IL-5或IL-10与凋亡率之间发现明显相关性，但发现IL-10/IL-5比值与EOS凋亡率有显著正相关，提示在炎症局部，凋亡并非由单一因子决定，而是受到因子间相互作用的影响。IL-5与IL-10的相互变动不仅决定炎症的启动和进展，亦影响炎性细胞的凋亡和炎症消散。
基金项目：国家自然科学基金资助（39570329）
参考文献
1，刘春涛，王曾礼，冯玉麟，等. 哮喘动物模型气道中白细胞介素5、10的动态变化及其意义. 中华结核和呼吸杂志，2000，4：239-242.
2，Wedi B, Raap U, Lewrick H, et al. Delayed eosinophil progrommed cell death in vitro: a common feature of inhalant allergy and extrinsic and intrinsic atopic dermatitis. J Allergy Clin Immunol , 1997,100:536-543.
3，郭晓明，赖克方，钱桂生，等. 哮喘豚鼠嗜酸性粒细胞凋亡及凋亡相关基因表达的研究. 中华呼吸和结核杂志, 1998, 12: 708.
4，Walsh GM. Mechanisms of eosinophil survival and apoptosis. Clin Exp Allergy, 1997, 27: 482-489.
（收稿日期：1999-09-13）
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