转录因子NF-κB在哮喘豚鼠肺组织和血液单个核细胞中的激活及地塞米松的作用

中华结核和呼吸感染 2000年第7期第23卷 论著

作者：张彦红　欧阳能太　徐军　钟南山

单位：510120 广州医学院广州呼吸疾病研究所

　　关键词： 哮喘；豚鼠；地塞米松

　　【摘要】　目的　探讨转录因子NF-κB在哮喘发病机制中的可能作用。方法　将豚鼠随机分为对照组8只，实验组24只（2、6、12 h时间点各8只），地塞米松处理组8只，在血液中单个核细胞和肺组织的细胞核提取物中，应用电泳迁移率实验和超迁移率实验检测NF-κB的激活水平和组成NF-κB的亚单位。结果　在卵蛋白致敏的豚鼠，诱喘后2 h，血中单个核细胞NF-κB的活性(244.1±2.4)与对照组（167.0±4.6)比较，差异有显著性（P＜0.05）；6 h达到最高水平(294.7±3.2)。进一步利用超迁移率实验证实，p50和p65抗体均参与NF-κB的组成。在肺组织，诱喘后2 h NF-κB的活性为(176.0±4.0），与对照组（67.3±2.5）比较，差异有显著性(P＜0.05）；6 h达到最高水平(282.3±6.8)。进一步利用超迁移率实验证实p50抗体参与。地塞米松干预后NF-κB活性(235.4±3.3；104.6±8.4)与实验组对照组（294.7±3.2；282.3±6.8）比较，差异均有显著性（P均＜0.05）。结论　NF-κB参与了哮喘的发病过程，NF-κB的激活和持续的高水平表达提示，NF-κB可能通过调节参与哮喘发病机制中的重要炎症因子的表达，从而使淋巴细胞的激活增生，炎症细胞迁移到肺脏炎症部位的过程中起着关键作用。地塞米松抑制NF-κB的表达，可能由此抑制炎症因子的表达从而达到抗炎作用的。

NF-κB activation and the inhibitory effect of dexamethasone in experimental asthmatic guinea pigs

ZHANG Yanhong, OUYANG Nengtai, XU Jun ,et al.

　　（Guangzhou Institute of Respiratory Diseases,Guangzhou 510120, China）

　　【Abstract】　Objective　To investigate the role of NF-κB in pathogenesis of asthma.Methods Electrophoresis mobility shift assay and supershift assay were used to analyze the expression of NF-κB activation and its components.Results Nuclear extracts prepared from the thoracic blood mononuclear cells and the whole lung tissue, respectively in OVA-sensitized and challenged guinea pigs, both displayed stronger DNA-binding activity at 2 h timepoint (244.1±2.4; 176.0±4.0) comparing to the control (167.0±4.6; 67.3±2.5), and the activity peaked at 6 h timepoint (294.7±3.2; 282.3±6.8) and continued till 12 h timepoint (200.9±1.2; 110.8±1.0). The activated NF-κB contained p50.Dexamethasone suppressed the NF-κB activation (235.4±3.3; 104.6±8.4) in the the nuclear extracts of the Blood mononuclear cells and the lung tissue, respectively.Conclusions This result showed that NF-κB were possibly through transcriptionally regulating the expression of many important inflammatory proteins. The dexamethasone could inhibit the activation of NF-κB in the allergic model, possibly through which the antiinflammatory action was exerted.

　　【Key words】　Asthma；　Guinea pig；　Dexamethasone

　　支气管哮喘是一种慢性气道炎症性疾病，许多细胞和炎症因子参与其中。研究发现，许多因子在哮喘患者中均有高水平的表达。在基因的表达过程中，转录因子在转录水平上的调控起着极其关键的作用。

　　NF-κB是一种参与许多炎症因子的表达调控的转录因子^［1］。我们的研究利用豚鼠制作哮喘模型，观察了NF-κB在其肺组织和血液中单个核细胞中的表达，并进行了糖皮质激素的干预处理，进一步了解NF-κB参与哮喘发病的过程。

　　材料与方法

　　一、材料

　　鸡卵蛋白购于美国Sigma公司，抗p65抗体和 抗p50抗体购于美国Santa Cruza公司，蛋白浓度测试试剂盒和电泳迁移率试剂盒分别购于美国BioRad 公司和美国Promega公司。豚鼠48只，均为雄性，体重250～300 g，购于北京医科大学动物中心。

　　二、豚鼠哮喘模型的制备和处理

　　哮喘模型的制备参照本实验室已建立的方法。将豚鼠随机分为实验组24只，腹腔注射10%的卵蛋白(OVA)1 ml，14 h后应用1%卵蛋白溶液诱喘，诱喘后2、6、12 h(每个时间点8只)分别于麻醉后心脏穿刺取血，置于含有抗凝剂的剂管中，混匀待行单个核细胞的分离；取出肺脏立即于液氮中冷冻后并储存于-70℃冰箱。待提取核蛋白。

　　对照组8只，腹腔注射同等量的生理盐水，饲养条件及取材方法同实验组。地塞米松处理组8只，在诱喘前10 min腹腔注射地塞米松(40 mg/kg)，分别于诱喘后6 h按同法进行取材。

　　三、单个核细胞（PBMC）分离

　　血液中单个核细胞的分离参考按常规方法进行。

　　四、核蛋白的提取

　　肺组织细胞核蛋白的提取^［2］和单个核细胞核蛋白的提取分别参照文献［3］进行，肺组织在液氮存在下研磨至粉末状后，同细胞的处理类似，经低温、低渗及破坏细胞膜（及核膜）试剂处理细胞后，高速离心（16 000 r/min），取含核蛋白的上清分装保存于-70℃备用。

　　五、标准曲线制作

　　以牛血清白蛋白制作标准曲线，参照试剂盒说明（Bradford法）测蛋白浓度。

　　六、电泳迁移率实验

　　标记探针序列如下：5′-AGT TGA GGG GAC TTT CCC AGG C-3′，3′-TCA ACT CCC CTG AAA GGG TCC G-5′。应用［γ-³²P］ATP(北京亚辉公司)标记，在T₄多核苷酸激酶作用下进行，聚丙烯酰胺凝胶纯化后与适量核蛋白（10 μg）进行结合反应，经8%聚丙烯酰胺凝胶电泳 3 h（在125 V电压下进行），80℃干胶后于-70℃下进行放射自显影，显影后利用凝胶分析系统（英国UVP公司）进行密度扫描，以扫描值作为NF-κB活性的量化值。超迁移率实验：于加入探针前先加入抗体适当量4℃下孵育30 min，其他步骤相同。

　　七、统计学处理

　　数据用均数±标准差表示，各组间比较利用方差分析和q检验，以P＜0.05为差异有显著性。

　　结果

　　一、NF-κB在血中单个核细胞的激活情况

　　NF-κB的活性在诱发后2 h（244.1±2.4）升高，与对照组（167.0±4.6)比较差异有显著性（P＜0.05）；6 h达到最高水平(294.7±3.2)，12 h有所降低(200.9±1.2，图1)，但高于对照组（P＜0.05）。进一步利用超迁移率实验证实p50和 p65抗体均参与激活的NF-κB的组成（图2）。

1 对照组；2～4分别为诱喘后 2、6、12 h组； 5 地塞米松处理组(6 h)

　　图1　卵蛋白致敏的豚鼠诱喘后血液中单个核细胞NF-κB活性动态变化及地塞米松的影响

1 阳性对照组；2 加抗p50抗体；3 加抗p65抗体；4 阴性对照组

　　图2　超迁移率实验：所用核蛋白来于诱喘后6 h组豚鼠血液中单个核细胞

1 对照组；2～4分别为诱喘后2、6、12 h组；5 地塞米松处理组(6 h)

　　图3　卵蛋白致敏的豚鼠诱喘后肺组织中的NF-κB活性动态变化及地塞米松的影响

1 阳性对照组；2 加抗p50抗体；3 加抗p65抗体

　　图4　超迁移率实验：所用核蛋白来于诱喘后6 h组豚鼠肺组织

　　二、NF-κB在肺组织的激活情况

　　NF-κB的活性在诱发后2 h（176.0±4.0）明显升高，与对照组（67.3±2.5）比较差异有显著性（P＜0.05）；6 h达到最高水平(282.3±6.8)，12 h即有所下降(110.8±1.0)，但高于对照组(图3)。

　　进一步利用超迁移率实验证实p50抗体参与（图4）。

　　三、地塞米松对NF-κB活性的抑制作用

　　在地塞米松干预组，血中单个核细胞的NF-κB的活性（235.4±3.3）明显低于实验组及对照组（294.7±3.2，P＜0.05）；肺组织的 NF-κB活性（104.6±8.4）明显低于实验对照组（282.3±6.8，P＜0.05）。

　　讨论

　　我们的研究发现在T淋巴细胞激活时，T淋巴细胞的IL-2、IL-2R的高表达起着关键的作用，NF-κB调控IL-2、IL-2R基因的转录表达^［1］；而IL-2可刺激单核细胞激活NF-κB；Liou等^［4］的研究发现，在c-Rel基因敲除小鼠的T淋巴细胞，对于由T细胞受体（TCR）介导的激活和增生信号刺激无反应，因此也检测不到IL-3、IL-2、IL-2R-α、粒-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）的表达。参与淋巴细胞激活的双信号刺激通路（TCR介导和CD28信号通路）均可导致NF-κB的激活^［5，6］。在本组实验中，OVA诱喘豚鼠后，单个核细胞及肺组织中NF-κB水平由2～12 h持续增高，提示NF-κB与淋巴细胞因子互相调控，参与了淋巴细胞的激活过程。同时研究表明,血管内皮细胞表面表达血管内皮细胞粘附因子1(VCAM-1)在嗜酸细胞迁移到肺脏炎症部位的过程中起关键作用，而VCAM-1的表达为NF-κB所调控^［1］，因此提示： NF-κB通过调节参与炎症的因子的表达而间接的参与炎症细胞的迁移。

　　超迁移率实验发现,在血液单个核细胞和肺组织中均有p50参与。在p50基因敲除的小鼠出现IgE转换障碍，提示p50在以IgE为主的免疫反应性疾病中的作用^［7］。在p50基因敲除的小鼠的哮喘模型上的研究结果也提示,p50参与了哮喘的发病机制^［8］。

　　现在认为糖皮质激素（GCs）与激素受体 (GR)复合物进入细胞核通过与其它转录因子（如NF-κB）相互作用进而发挥其抗炎功能^［9］。本组研究地塞米松干预后,在肺组织，血液中单个核细胞，与实验对照组比较，NF-κB的活性水平均明显下降（P均＜0.05）。提示GCs通过该机制阻断NF-κB结合目的基因的特异位点来抑制炎症因子的表达，从而达到抗炎作用的。

参考文献

　　1，Siebenlist U,Franzoso G,Brown K.Structure,regulation and function of NF- κB.Annu Rev Cell Biol,1994,10:405-455.

　　2，Blackwell TS,Blackwell TR,Holden EP,et al. In vivo antioxidant treatment suppresses nuclear factor-κB activation and neutrophilic lung inflammation. Journal of Immunology,1996,157:1630-1637.

　　3，Schreiber E, Matthias P,Muller MM, et al. Rapid detection of octamer binding proteins with `miniextracts', prepared from a small number of cells. Nucleic Acids Research,1989,17:6419.

　　4，Liou HC,Jin Z,Tumang J,et al. c-Rel is crucial for lymphocyte proliferation but dispensible for T cell effector function.Int Immunol,1999,11:361-371.

　　5，Los M, Schenk H, Hexel K, et al.IL-2 gene expression and NF-κB activation through CD₂₈ requires reactive oxygen production by 5-lipoxygenase.EMBO J,1995,14:3731-3740.

　　6，Dorada B, Portoles P,Ballester S.NF-κB in Th₂ cells:delayed and long-lasting induction through the TCR complex. Eur J Immunol,1998,28:2234-2244.

　　7，Snapper,CM,Zelazowski P, Rosas FR, et al. B cells from p50/NF-κB knockout mice have selective defects in proliferation,differentiation,germ-line CH transcription and Ig class switching.J Immunol, 1996,156:183-191.

　　8，Yang L, Cohn L, Zhang DH, et al.Essential role of nuclear factor κB in the induction of eosinophilia in allergic airway inflammation. J Exp Med ,1998 ，188:1739-1750.

　　9，Ray A, Prefontaine K. Physical association and functional antagonism between the p65 subunit of transcription factor NF-κB and the glucocorticoid receptor. Proc Natl Acad Sci USA,1994, 91:752-756.

(收稿日期:1999-09-07)