过氧亚硝基阴离子在哮喘豚鼠气道高反应性中的作用

中华结核和呼吸感染 2000年第9期第23卷 论著

作者：朱铁年　凌亦凌　赵瑞景　王殿华　李彦群　谷振勇　刘满英

单位：朱铁年 凌亦凌 王殿华 谷振勇（050017 石家庄，河北医科大学病理生理教研室）；赵瑞景（免疫学教研室）；李彦群（癌检中心）；刘满英（医化教研室）

　　关键词： 哮喘；过氧亚硝基阴离子；气道高反应性；豚鼠

　　【摘要】　目的　探讨哮喘豚鼠肺内过氧亚硝基阴离子（ONOO^-）的生成及其在哮喘气道高反应性形成中的作用。方法　18只哮喘豚鼠模型随机分为3组：（1）哮喘组（6只）：用10%卵蛋白1 ml腹腔注射致敏，2周后用1%卵蛋白超声雾化吸入复制豚鼠哮喘模型。（2）哮喘加氨基胍（AG）组（6只）：诱喘同哮喘组，在每次诱喘前1 h腹腔注射AG 10 mg/kg。（3）正常对照组（6只）：用生理盐水代替诱喘剂。每组哮喘豚鼠均用免疫组织化学技术检测肺内ONOO^-的生成及定位；用健康豚鼠15只制备气管条，观察外源性ONOO^-对离体豚鼠气管条反应性的影响，电镜观察ONOO^-对气道上皮细胞的损伤情况。结果　哮喘豚鼠支气管肺组织中有ONOO^-特异性标志物-硝基酪氨酸（NT）的过量生成，主要分布于气道上皮细胞和小气道周围炎性细胞内；加用AG组，NT阳性细胞减少；正常对照组仅有较少的NT阳性细胞；ONOO^- 0.5mmol/L组气管条对各浓度组胺(10^-8mol/L除外)的反应性与溶剂对照组比较，差异有显著性(P分别＜0.05、＜0.01及＜0.001)；ONOO^- 0.5 mmol/L组气管条对组胺反应的敏感性与溶剂对照组比较，差异有显著性（P＜0.001）；电镜观察ONOO^-可致气管粘膜上皮细胞损伤、脱落。结论　哮喘豚鼠气道上皮细胞内有过量ONOO^-生成，ONOO^-可能通过介导气道上皮细胞损伤参与哮喘气道高反应性的形成。

Role of peroxynitrite on airway hyperresponsiveness in asthmatic guinea-pigs

ZHU Tienian，LING Yiling，ZHAO Ruijing,et al.

　　（Department of Pathophysiology，Hebei Medical University，Shijiazhuang 050017，China）

　　【Abstract】　Objective　To study the formation and localization of peroxynitrite(ONOO^-) in the lung tissues of asthmatic guinea pig and investigate the effects of ONOO^- on airway hyperresponsiveness in asthma.Methods　 18 guinea pigs were randomly divided into three groups of 6 each: (1) asthmatic group: guinea pigs were injected intraperitoneally with 1 ml of 10% ovalbumin. After 14 days，the animals were exposed to aerosol of 1% OVA; (2) aminoguonidine (AG) group: Animal immunization was the same as above，but 1 h before the animals were exposed to OVA aerosol，10 mg/kg AG were injected intraperitoneally.(3) control group. The formation and localization of ONOO^- in the lung tissues of the guinea-pig asthma model were observed by immunohistochemical detection. The effect of exogenous ONOO^- on contractions of isolated tracheal strips of the guinea-pigs to various concentrations of histamine was examined. The damage of airway epithelial cells induced by ONOO^- was observed by electron microscopy.Results　 There was strong immunoreactivity for nitrotyrosine (NT)，a specific marker of ONOO^- formation in vivo，in the airway epithelisl cells and inflammatory cells surrounding small airways of the guinea-pigs with asthma. The AG group showed significantly decreased number of NT positive cells in the lung tissues. There were only a few NT positive cells in the control group. The responsiveness of isolated tracheal strips to various concentration of histamine（except 10^-8mol/L） in the ONOO^- 0.5 mmol/L group were significantly increased compared with the vehicle group. (P＜0.05,P＜0.01 or P＜0.001). The sensitivity of isolated tracheal strips to histamine in the ONOO^- 0.5　mmol/L group were also increased compared with the vehicle group（P＜0.001). Electron microscopical observation of the airways revealed airway epithelial injury and shedding.　Conclusion　There was ONOO^- overproduction in airway epithelial cells of asthmatic guinea-pigs，which may contribute to airway epithelial damage and hyperresponsiveness in asthma.

　　【Key words】　Asthma；　Peroxynitrite；　Airway hyperresponsiveness；　Guinea-pig

　　新近研究表明，在体内一氧化氮（NO）与超氧阴离子（）可快速反应形成氧化作用更强的过氧亚硝基阴离子（ONOO^-），其生物学作用可介导多种细胞损伤，是NO产生病理性损伤的主要发病环节^［1］。Ischiropoulos等^［2］发现，ONOO^-可使蛋白质酪氨酸残基硝基化生成代谢物硝基酪氨酸（NT），而、NO及其氧化还原形式则无此作用，目前公认，NT是ONOO^-在体内生成的特异性标志物。应用免疫组织化学技术证实，在急性肺损伤、内毒素血症、肺缺血再灌注损伤等多种与NO和过量产生有关的病理过程中肺组织均有ONOO^-特异标志物NT产生^［3］。哮喘发病过程中气道上皮细胞及多种炎细胞如嗜酸细胞、中性粒细胞、巨噬细胞等活化可诱生大量NO和^［4］，关于哮喘发病过程中气道上皮细胞内是否有ONOO^-生成及其在气道反应性中的可能作用，目前国内、外报道较少。我们的研究旨在应用豚鼠哮喘模型，观察哮喘豚鼠肺内ONOO^-的生成及其定位，以及外源性给予ONOO^-对离体豚鼠气管条反应性的影响，探讨哮喘发病过程中气道上皮细胞内ONOO^-生成及其在哮喘气道高反应性形成中的可能作用。

　　材料与方法

　　一、材料

　　1．实验动物：健康Dunkin-Hartly豚鼠33只，雌雄不拘，体重350～450 g，由河北省实验动物中心提供。

　　2．试剂：卵蛋白、诱导型NO合酶（iNOS）抑制剂氨基胍（AG），二氨基联苯胺（DAB）及磷酸组胺（histamine）均为美国Sigma公司产品，硝基酪氨酸单克隆抗体购自美国Cayman公司，试剂盒即过氧化物酶标记的链霉素-亲和素试剂盒，为美国Zymed公司产品，其余试剂均为国产分析纯。

　　二、方法

　　1．哮喘豚鼠模型的建立及分组：（1）哮喘组（6只）：用10% 的卵蛋白生理盐水腹腔注射致敏，2周后用1%的卵蛋白生理盐水雾化吸入激发；（2）哮喘加AG组（6只）：抗原激发前1 h腹腔注射AG 10 mg/kg；（3）对照组（6只）：用同样的方法致敏，但用生理盐水代替1% 的卵蛋白生理盐水雾化吸入激发。

　　2．免疫组织化学染色：各组豚鼠分别于激发后12 h，过量戊巴比妥钠腹腔注射处死，取右下肺组织，10%福尔马林溶液固定，常规石蜡包埋，切片，用于免疫组化和HE染色。SP免疫组化染色步骤：3% H₂O₂甲醇溶液室温孵育15 min，封闭内源性过氧化物酶活性；10%正常山羊血清室温孵育10 min，封闭非特异性抗原抗体反应；鼠抗硝基酪氨酸单克隆抗体（10 μg/ml）4°C过夜；生物素标记的羊抗鼠IgG 37 ℃ 30 min；辣根酶标记的链霉卵白素37 ℃ 30 min；DAB呈色，苏木素复染。以上各步骤间均以0.01 mol/L（pH 7.2）PBS液彻底冲洗。最后脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

　　免疫组化染色对照设置：以PBS液（pH 7.2）代替一抗行上述染色作为空白对照。

　　3．ONOO^-的合成：参照Beckman等^［1］方法通过淬灭流动反应器(quenched-flow reactor)合成ONOO^-，应用日本岛津UV-2201紫外分光光度计测定波长302 nm的ONOO^-浓度，-80 ℃冰箱储存备用。将ONOO^-储存液于100 ℃加热5 min，制备分解的ONOO^-作为分解产物对照。

　　4．离体气管条对组胺反应性的测定：健康豚鼠15只，击头处死后，剖取气管，沿前正中线纵行切开，以每3个软骨环为一组横切制成气管条。实验分组(每组9条)：(1) ONOO^- 0.5 mmol/L组；(2) ONOO^-分解产物组；(3) 溶剂对照组：溶剂为与(1) 组等pH的0.9%生理盐水。将制备好的气管条悬挂于盛有6 ml Krebs液（NaCl 118 mmol/L，KCl 4.7 mmol/L，CaCl₂ 2.5 mmol/L，MgSO₄ 1.2 mmol/L，KH₂PO₄ 1.2 mmol/L，NaHCO₃ 25 mmol/L，葡萄糖11.1 mmol/L）浴槽中，37 ℃恒温，持续通95％ O₂和5％ CO₂混和气体。MS-302多媒体化生物信号记录分析系统记录气管条张力变化。以0.1 mmol/L组胺预收缩气管条，于气管条恢复基础张力后，在浴槽中加入ONOO^-避光孵育15 min，更换Krebs液，至肌条稳定后，用累积方法建立组胺累积浓度-反应曲线。

　　5．电镜标本的留取：以同样实验条件将豚鼠离体气管条放入浴槽中，取ONOO^- 0.5 mmol/L组、ONOO^-分解产物组和溶剂对照组部分气管条，2.5％戊二醛固定制片，进行扫描电镜观察。

　　三、统计学处理

　　气管条的反应性以其占气管条对0.1 mmol/L组胺预收缩反应的百分比表示；气管条的最大收缩反应以E_max表示；气管条反应的敏感性以pD₂(-logEC₅₀)表示，即气管条收缩达到50％时组胺浓度的负对数。所有数据以±s表示，用t检验判定组间的差异显著性。

　　结果

　　一、肺组织病理变化

　　对照组肺组织结构完整，各级支气管管腔规则，粘膜上皮整齐，无脱落（图1）。哮喘组豚鼠肺内小支气管粘膜层及平滑肌周围大量嗜酸细胞浸润，并可见淋巴细胞和嗜中性粒细胞浸润，气道粘膜下水肿，气道腔内可见脱落的气道上皮细胞、渗出的炎细胞与气道分泌物共同形成的混合栓子（图2）；AG组小气道炎性细胞浸润较轻（图3）。

图1　正常豚鼠肺组织，小支气管腔规则，粘膜上皮整齐　HE　×200

图2　哮喘豚鼠肺组织，小支气管收缩，粘膜下水肿，

　　粘膜层及平滑肌周围嗜酸细胞浸润　HE　×200

图3　使用AG后哮喘豚鼠小气道炎性细胞浸润减少　HE　×100

　　二、免疫组织化学染色结果

　　哮喘组肺内小气道可见大量ONOO^-特异性标志物-硝基酪氨酸(NT)阳性信号，主要定位于气道上皮细胞及浸润的炎性细胞内，气道平滑肌细胞内也有弱的阳性信号，阳性信号呈棕褐色，分布于细胞胞浆内（图4）；对照组气道上皮细胞内可见较弱的NT阳性信号（图5）；AG组NT阳性细胞较少（图6）。空白对照呈阴性反应。

图4　哮喘豚鼠NT免疫反应阳性信号(棕褐色)见于气道上皮细胞及

　　其周围炎性细胞,气管平滑肌细胞也有弱的NT阳性信号　SP　×200

图5　对照组豚鼠气道上此细胞有较弱的NT免疫反应阳性信号　SP　×100

图6　使用AG后哮喘豚鼠肺组织NT免疫反应阳性细胞减少　SP　×100

　　三、ONOO^-对豚鼠离体气管条反应性的影响

　　分解产物组与溶剂对照组比较,气管条对各浓度组胺的反应性及敏感性（pD₂）比较差异均无显著性（P＞0.05），表明ONOO^-分解产物对气管条的反应性无明显影响。ONOO^- 0.5 mmol/L组气管条对各浓度组胺(10^-8mol/L除外)的反应性均明显增高，与溶剂对照组对应浓度组胺的反应性比较差异均有显著性(P分别＜0.05、＜0.01及＜0.001)，气管条的最大收缩反应（Emax）由溶剂对照组的（100±5）% 增高至（127±11）%，两组比较差异有显著性（P＜0.001）；ONOO^- 0.5 mmol/L组气管条对组胺反应的敏感性与溶剂对照组比较差异也有显著性（P＜0.001，图7，表1）。

图7　ONOO^-对离体豚鼠气管反应性的影响

表1　ON00^-对离体豚鼠气管条pD₂和Emax的

　　影响(±s)

　　注:与溶剂对照组比较^* P＜0.001

四、ONOO^-对豚鼠气管上皮细胞损伤的电镜变化

　　气管粘膜面扫描电镜显示，溶剂对照组与ONOO^-分解产物组气管粘膜面纤毛细胞规整，其间夹有杯状细胞，纤毛细胞游离面纤毛及杯状细胞表面微绒毛排列整齐（图8，9）；ONOO^- 0.5 mmol/L组气管粘膜上皮细胞脱落，脱落的细胞可见细胞膜破裂，细胞核、细胞器及分泌颗粒等暴露（图10）。

图8　溶剂对照组豚鼠气道上皮细胞　扫描电镜　×5000

图9　ONOO^-分解产物处理后气道上皮细胞　扫描电镜　×4000

图10　ONOO^-处理后气道上皮　扫描电镜　×2000

　　讨论

　　1990年Beckman等^［1］首次提出ONOO^-具有生物学作用，在体内NO与可发生快速反应生成ONOO^-，与NO和相比，ONOO^-具有更强的氧化性。ONOO^-质子化形成共轭酸过氧亚硝酸（ONOOH），尤其是ONOOH的变构高能态ONOOH^．以及ONOO^-的其他中间衍生物如HO^．、N、NO⁺₂等也具有明显的氧化或硝基化作用。随着对NO研究的逐步深入，已有不少研究发现，ONOO^-是NO产生病理损伤作用的主要环节。体外研究表明，ONOO^-可调节血小板的功能^［5］，削弱大鼠离体血管的舒张功能^［6］，抑制Ⅱ型肺泡上皮细胞的代谢^［7］，破坏并减少肺泡表面活性物质的产生^［8］。在休克、缺血-再灌注损伤、败血症、肺纤维化及感染性炎症等病理过程中，均证明有ONOO^-的产生，其作用也愈来愈受到重视。

　　在哮喘发病过程中，前炎症细胞因子肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1（IL-1）和干扰素γ（IFN-γ）等可使气道上皮细胞iNOS表达增多，产生大量NO；IL-5、粒-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、IL-8等使嗜酸细胞、中性粒细胞等在气道聚集、活化产生^［9］。本组实验发现，致敏豚鼠免疫激发后12 h，支气管上皮细胞及气道周围炎细胞内ONOO^-特异性标志物NT免疫阳性细胞明显增多，表明在哮喘发病过程中有ONOO^-的过量生成。应用iNOS抑制剂AG后，NT免疫阳性细胞明显减少，表明由iNOS诱生的大量NO在ONOO^-形成中起关键性作用。

　　气道高反应性是哮喘的重要特征，作为气道结构细胞的气道上皮细胞既可作为效应细胞，产生和分泌各种炎症介质、细胞因子和氧自由基等，又是炎症介质的主要靶细胞^［10］，气道上皮细胞损伤是哮喘气道高反应性形成的主要原因。本组实验研究发现，用ONOO^-与离体豚鼠气管条共同孵育后，气管条的反应性及敏感性均增高，同时电镜观察有气道上皮细胞损伤、脱落，表明ONOO^-所引起的气道反应性增高可能与ONOO^-介导的气道上皮细胞损伤有关。气道上皮细胞受损后，其屏障功能丧失，气道粘膜下神经末梢暴露，使气道易于受刺激引起气道平滑肌收缩；气道上皮细胞功能受损妨碍其生成舒张气道平滑肌的介质和降解收缩气道平滑肌的介质，使气道反应性增高。据此推测在哮喘发病过程中，过量产生的NO与炎细胞产生的快速生成ONOO^-，可能通过介导气道上皮细胞的损伤参与哮喘气道高反应性的形成。提示从防止NO、和ONOO^-的大量生成入手，以及应用相应的清除剂，将为哮喘的防治提供新的对策。关于ONOO^-通过何种机制介导气道上皮细胞损伤参与哮喘气道高反应的形成，有待于进一步研究。

　　金项目：河北省卫生厅科学基金资助项目（98020）

参考文献

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(收稿日期：2000-03-01)