幽门螺杆菌粘附素基因hpaA的克隆及序列分析

　　军事医学科学院院刊2000年第24卷第2期

陈烨　张兆山　王继德　周殿元

　　摘　要　目的：对一株临床分离的高粘附力幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,Hp）菌株M1进行粘附素基因hpaA的序列分析，为研究Hp的粘附提供分子基础。方法：设计hpaA的特异引物，将PCR产物插入pUC19载体构建hpaA的重组克隆，DNA自动分析仪进行序列测定，Clustal x和Homology软件分析DNA及其推导出的氨基酸序列。结果：构建了粘附素HpaA的重组质粒pUC-hpa，测序显示hpaA结构基因长783 bp，开放读框完整,无中断，与文献报道的序列有差异；该基因编码261个氨基酸，其中一段氨基酸序列KRTIQK与大肠杆菌粘附素K99、SfaS、CFA/Ⅰ中的涎酸结合位点的结构相似。结论：Hp粘附素基因hpaA在不同菌株存在差异，但其粘附作用有相似的分子基础。

　　关键词：幽门螺杆菌；粘附素；基因克隆；序列分析

　　幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,Hp）已被确认是慢性胃病(包括胃炎和消化性溃疡)的主要病原因子，与胃癌亦密切相关，但其致病机理尚不甚明了。Hp能在胃内定植是其致病的前提，而粘附则是定植的关键，这种粘附作用是由特异的粘附素-受体介导的。已知N-乙酰神经氨酰乳糖结合原纤维血凝素（NLBH,HpaA）是Hp的主要粘附素之一，它能与多种胃上皮细胞表面受体包括神经节苷脂GM3、硫酸脑苷脂(SLC)及层粘蛋白上的涎酸乳糖成分结合^［1,2］，使Hp紧密粘附于胃上皮细胞，从而进一步发挥对胃粘膜的损伤作用。本研究拟通过DNA重组技术获得粘附素HpaA的结构基因，测序分析hpaA基因及其氨基酸序列特征，推测HpaA上可能的受体结合部位，为进一步研究Hp粘附的分子机制打下基础。

　　1　材料和方法

　　1.1　材料

　　1.1.1　菌株和质粒　菌株JM109及质粒pUC19由军事医学科学院生物工程研究所提供。高粘附力幽门螺杆菌菌株M1为本所保存。

　　1.1.2　工具酶及试剂　限制性内切酶EcoRⅠ、BamHⅠ及T₄ dNA 聚合酶、Vent DNA聚合酶购自New England Biolabs公司，Taq DNA聚合酶、 dNA分子量标准λDNA/EcoR Ⅰ+Hind Ⅲ购自华美生物工程公司，琼脂糖、dNTPs、DNA快速纯化试剂盒购自Promega公司，测序质粒纯化试剂盒购自Qiagen公司，其他试剂为国产分析纯。

　　1.2　方法

　　1.2.1　Hp染色体DNA的提取　从固体培养基上刮取生长良好的Hp菌落，1×TE(pH8.0)洗涤后采用酚/氯仿混合提取法^［4］抽提。

　　1.2.2　质粒的提取及纯化　质粒的快速抽提及大量制备均采用碱变性法，详见参考文献［3］。

　　1.2.3　目的基因的PCR扩增　根据文献［6］设计引物，在其5′端加上合适的限制性酶切位点，由军事医学科学院生物工程研究所张京生合成。序列如下：

　　引物1：5′-CGGAATTC ATG AGA GCA AAT AAT C-3′　　　　　EcoRⅠ

　　引物2：5′-CGGGATCC TTC TTA TGC GTT ATT TG-3′　　　　BamHⅠ

　　热启动法进行PCR^［4］，94℃变性30 s，50℃退火40 s，72℃延伸90 s，30个循环后再延伸10 min。1.0%琼脂糖凝胶电泳观察扩增结果。

　　1.2.4　DNA片段的酶切、连接、转化和阳性克隆的鉴定　详见参考文献［3］。质粒pUC19和目的基因DNA经EcoR Ⅰ和BamHⅠ双酶切，玻璃奶回收酶切片段，T4连接酶作用下16℃连接12 h,转化宿主菌JM109，双酶切鉴定筛选出阳性克隆。

　　1.2.5　序列测定及分析　ABI 373A DNA自动分析仪进行序列测定。从GeneBank中检索Hp粘附素HpaA及大肠杆菌粘附素SfaS、K99、SfaA～G、CFA/Ⅰ、CFA/Ⅳ的核苷酸序列，Clustal X和Homology软件分析DNA及氨基酸序列的结构特点。

　　2　结果

　　2.1　pUC-hpa重组质粒的构建

　　粘附素基因hpaA基因长约800 bp，其PCR结果见图1。重组质粒pUC-hpa经EcoRⅠ、BamHⅠ双酶切鉴定结果见图2。

图1　PCR产物的1%琼脂糖凝胶电泳结果

　　1.hpaA基因扩增产物；2.λDNA/EcoRⅠ+HindⅢ

图2　pUC-hpa重组质粒的酶切鉴定

　　1.λDNA/EcoRⅠ+HindⅢ；2.pUC-hpa/EcoRⅠ;

　　3.pUC-hpa/EcoRⅠ+BamHⅠ;4.pUC19/EcoRⅠ；

　　5.hpaA基因扩增产物

　　2.2　重组质粒pUC-hpa的序列分析

　　利用pUC19上的通用引物对重组质粒进行序列测定，其DNA及推导出的氨基酸序列如图3。与Evans等^［5］及O′Tool等^［6］报道的DNA序列同源性分别为93.5%(751/803)和97.0%(779/803)，与Jones等^［7］的报道几乎一致，仅331位碱基有差异。氨基酸序列分析显示在133～139位存在一段KRTIQK结构，该结构与大肠杆菌E.coli粘附素SfaS、K99及CFA/I中涎酸结合位点的结构相似，见表1。

图3　Hp粘附素基因hpaA的核苷酸序列及其推导出的氨基酸序列（划线部分为可能的受体结合区）

表1　HpaA与大肠杆菌粘附素SfaS、K99及CFA/Ⅰ中涎酸结合区的氨基酸结构比较

　　* K和R，T和A，I和V，Q和D为功能相似氨基酸；

　　# CFA b为CFA/Ⅰ的亚单位之一3　讨论

　　早在1988年，Evans等^［8］就发现Hp上存在一种原纤维样血凝素（NLBH），能与人红细胞紧密结合，血凝抑制试验证实N-乙酰神经氨酰乳糖（涎酸乳糖）是其受体的主要成分；随后他们又纯化了NLBH并克隆了相应基因hpaA，发现基因全长约1.4 kb，存在3个开放读框（ORFs），其中ORF2长549 bp，是NLBH的主要结构基因（hpaA），编码相对分子质量20000的蛋白^［5］；但此后有学者对此提出异议，认为hpaA结构基因长783 bp，包含了Evans等所述的ORF2和ORF3，编码相对分子质量28 000～29000的蛋白。根据上述情况，我们在设计引物时综合考虑两方面的因素，上游引物从ORF2的起始密码子ATG开始，下游引物取ORF3终止密码子TAA后的十几个碱基，5′端分别引入常用的EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位点及两个保护性碱基以便于操作。序列分析结果显示克隆的hpaA基因片段与Jones等^［7］的报道基本一致，与Evans^［5］及O′Tool等^［6］的报道有较大变化，说明HpaA基因在不同菌株间存在着差异。

　　但不论何种情况，成熟的HpaA蛋白均有一段氨基酸序列KRTIQK，在结构上与大肠杆菌粘附素的涎酸乳糖结合部位的氨基酸序列相似，说明不同细菌的粘附可能存在相似的物质基础。

　　细菌与宿主细胞的特异性粘附是由粘附素-受体系统介导的，通常这种粘附作用依赖于粘附分子上某些特定的氨基酸位点与受体的结合。已知涎酸是许多糖蛋白和糖脂的末端组成部分，这一暴露性位置使它成为细胞和分子间相互作用的重要调节因子。近年来识别涎酸基团的细菌粘附素陆续有报道，但对其分子水平的粘附机制却知之甚少，研究得较成熟的是大肠杆菌粘附素系列。通过寡核苷酸介导的定点诱变技术显示，大肠杆菌E.coli k99菌毛粘附素中132位赖氨酸和136位精氨酸的突变可以使细菌的粘附能力完全丧失，提示在与受体分子上带负电荷的涎酸残基作用时，氨基酸所带的正电荷十分重要^［9］；Morschhauser等^［10］报道E.coli另一涎酸结合粘附素SfaS具有一段与K99类似的氨基酸序列，116位赖氨酸和118位精氨酸直接影响SfaS与受体分子上涎酸基团的结合；相似的结构区亦见于受体为涎酸糖蛋白的CFA/Ⅰ粘附分子中^［11,12］。Evans等^［8］曾报道在Hp粘附素HpaA中有一段氨基酸序列KRTIQK，包含该序列的十二肽免疫所得抗血清能阻断Hp与人红细胞的凝集，并且免疫电镜显示它所识别的成分位于Hp菌体表面。我们所测hpaA dNA序列虽然与Evans等报道有较大差异，但在氨基酸序列中可找到相同的结构区，多序列分析软件显示它与上述E.coli粘附素中的涎酸结合区在结构上类似。至于在功能上它是否确为受体结合区，包含该结构区的HpaA在Hp与宿主细胞的粘附中的地位到底如何，尚需进一步研究。

　　感谢军事医学科学院生物工程研究所王国力老师、岳俊杰老师、朱旭东博士在序列分析中给予的无私帮助。

　　［基金项目］国家自然科学基金资助项目(39700007)

　　［作者简介］陈烨(1971-)，女，江苏扬州人，主治医师，讲师，博士。

　　陈烨(第一军医大学全军消化内科研究所，广州　510515)

　　张兆山(军事医学科学院生物工程研究所，北京　100071)

　　王继德(第一军医大学全军消化内科研究所，广州　510515)

　　周殿元(第一军医大学全军消化内科研究所，广州　510515)

　　参考文献

　　［1］Valkonen KH,Wadstrom t,Moran AP.Identification of the N-acetylneuraminyllactose-specific laminin-binding protein of Helicobacter pylori［J］.Infect Immun,1997,65(3):916.

　　［2］Simon PM,Goode PL,Mobasseri A，et al.Inhibition of Helicobacter pylori binding to gastrointestinal epithelial cells by sialic acid-containing oligosaccharides［J］.Infect Immun,1997,65(2):750.

　　［3］Ausubel FM,Brent R,Kingston RE，et al.颜子颖，王海林译.精编分子生物学实验指南［M］.北京：科学出版社，1998.39.

　　［4］Sambrook J,Fritsch EF,Maniatis T.Molecular cloning:a laboratory manual［M］.2nd ed.New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989.35.

　　［5］Evans DG,Karjalainen TK,Evans DJ Jr，et al.Cloning,nucleotide sequence,and expression of a gene encoding an adhesin subunit protein of helicobacter pylori［J］.J Bacteriol,1993,175(3):674.

　　［6］O′Toole PW,Janzon L,Doig P，et al.The putative neuraminyllactose-binding hemagglutinin HpaA of Helicobacter pylori CCUG17874 is a lipoprotein［J］.J bacteriol,1995,177(21):6049.

　　［7］Jones AC,Logan RP,Foynes S，et al.A flagellar sheath protein of helicobacter pylori is identical to HpaA,a putative N-acetylneuraminyllactose-binding hemagglutinin,but is not an adhesin for AGS cells［J］.J bacteriol,1997,179(17):5643.

　　［8］Evans DG,Evans DJ Jr,John JM，et al.N-acetylneuraminyllactose-binding fibrillar haemagglutinin of Campylobacter pylori:a putative colonization factor antigen［J］.Infect Immun,1988,56(11):2896.

　　［9］Jacobs AA,Simons BH,de Graaf FK.The role of lysine-132 and arginine-136 in the receptor-binding domain of the K99 fibrillar subunit［J］.EMBO j,1987,6(6):1805.

　　［10］Morschhauser J,Hoschutzky H,Jann K，et al.Functional analysis of the sialic acid-binding adhesin SfaS of pathogenic Escherichia coli by site-specific mutagenesis［J］.Infect Immun,1990,58(7):2133.

　　［11］Pieroni P,Worobec EA,Paranchych W，et al.Identification of a human erythrocyte receptor for colonization factor antigen I pilli expressed by H10407 enterotoxigenic Escherichia coli［J］.Infect Immun,1988,56(5):1334.

　　［12］Jordi BJ,Willshaw GA,van der Zeijst BA，et al.The complete nucleotide sequence of region 1 of the CFA/I fimbrial operon of human enterotoxigenic escherichia coli［J］.DNA Seq,1992,2(4):257.