小鼠血吸虫感染后肝脏羟脯氨酸含量测定方法的实验研究

寄生虫与医学昆虫学报 2000年第1期第7卷 简　报

作者：应奇才　周承

单位：应奇才（杭州医学高等专科学校机能实验室　杭州　310012）；周承（浙江大学附属第一医院传染病研究所，杭州　310005）

LABORATORY EXPLORE ON BIOCHEMICAL ASSAY OF

　　HYDROXYPROLINE IN SCHISTOSOMIASIS MICE LIVERS

Ying Qicai

　　（Hangzhou Medical College　310012）

　　Zhun Cheng

　　（The Institute of Infectious Diseases,the first affiliated hospital of Zhejiang University　310005）

　　机体胶原蛋白的主要特征性成份之一为羟脯氨酸，它占胶原蛋白氨基酸总量的13%，因此测定肝脏组织的羟脯氨酸含量，是反映肝脏纤维化程度的直接指标。但传统的测定方法有待进一步完善，在此作者进行了部分改进。

　　1　材料和方法

　　1.1　实验材料

　　用日本血吸虫大陆株尾蚴30±2条感染ICR小鼠80只，分别于4周、5周、6周、7周、8周、9周、11周、12周、14周、16周剖杀小鼠，每次6～8只，取其肝脏备测，同时以10只正常同种小鼠为对照。

　　1.2　测定方法

　　将肝组织剪碎，置于青霉素小瓶中，用乙醚、丙酮混合液脱脂2～3次，每次24 h以上，110℃烘干致恒重，称取3mg～6 mg，加工1 mL 6 mol/L HCl于具塞试管中，于98℃水解28h，冷却后加6 mol/LNaOH中和，稀释至5.0 mL，取0.5 mL水解液，用氯胺T法(金博，1994)测定其羟脯氨酸含量。

　　2　结果与讨论

　　2.1　实验条件

　　2.1.1　水解方式　对胶原纤维的水解方式见于各种报道(金博等，1994；许志勤等，1990；宋代军等，1987；Mitchell AD et al.,1970;Reddy GK,1996)，主要为110℃酸式水解24 h及125℃、压力20磅下酸式水解3 h。经作者试验发现：110℃水解24 h，极易爆腾、烧干；125℃高压水解，亦易发生爆裂。作者经过重复试验发现，在98℃水解28h，可达到酸式水解完全。测定结果如表1。

表1　不同水解方式对肝HYP测定的影响

　　Tab.1　The effects of various hydrolysis conditions on the detections of liver hydroxyproline

水解方式 　　Hydrolysis conditions	样品数 　　Samples	HYP含量(ug/mg)(±s) 　　Contents of Hyp(ug/mg)(±s)
110℃水解24h 　　be hydrolysised in 24 hours 　　with the temperature 110℃	10	15.34±2.64
98℃水解28h 　　be hydrolysised in 28 hours 　　with the temperature 98℃	10	14.52±2.46
125℃高压水解3h 　　be hydrolysised on high pressure in 3 hours 　　with the temperature 125℃	10	15.17±2.73

　　经统计学检验表明，不同水解方式对羟脯氨酸测定无显著性影响。在98℃酸式水解28 h，可避免110℃水解的爆腾、烧干和125℃高压水解的爆裂现象，使测定方法较为安全可靠。

　　2.1.2　测定体系中PH的影响　据文献报道(许志勤等，1990；宋代军等，1987)，水解液需精确调pH至5～7后才可测定。作者将水解好的样品分别在调pH至5～7后、直接(此时pH＜0)及部分中和(加入一定量NaOH，使pH在2～6的范围内)测定羟脯氨酸含量，结果如下表2：

表2　pH对肝Hyp测定的影响

　　Tab.2　The effects of pH on the detections of liver hydroxyproline

pH	样本数 　　Samples	Hyp 含量(μg/mL)(±s) 　　Contents of hydroxyproline
5～7	10	1.78±0.23
＜0	10	1.42±0.21
2～6	10	1.69±0.25

　　由此可得，pH不调与调有明显差异(t=3.655，P＜0.01)，pH粗调与精调没有显著差别(t=0.838，P＞0.05)。而将pH调至5～7过于繁锁，只需粗略估算需加NaOH量，使pH在2～6的范围内，对结果没有影响。

　　综上所述，可以确定小鼠肝组织羟脯氨酸含量测定的适宜条件：1)肝组织在98℃，28 h内酸式水解完全；2)水解后只要粗略估算需加NaOH的量，使水解液pH在2～6范围内，而不必精确调pH。因而使羟脯氨酸测定更为简便、准确，具有一定推广价值。

　　2.2　羟脯氨酸测定方法在小鼠血吸虫病肝纤维化研究中的应用

　　将本法应用于日本血吸虫病小鼠肝纤维化的动态研究中，结果如图1所示：

图1　小鼠感染日本血吸虫后肝脏羟脯氨酸的动态变化

　　Fig.1　Hydroxyproline in the livers of mice after infection with Schistosoma japonica at different times

　　本研究得到浙江省自然科学基金资助(基金编号395120)

参考文献

　　1，许志勤，高兰兴.1990.组织羟脯氨酸测定方法的改进.解放军预防医学杂志，(6)：40～41.

　　2，宋代军，顾德官，茅守玉.1987.高血压大鼠尿和组织中羟脯氨酸的测定.上海第二医科大学学报，7(1)：58～59.

　　3，金博，李玉彬，王朝，等.1994.氯氨T法测定羟脯氨酸含量的方法改进.陕西医学检验，9(3)：176.

　　4，Reddy,G.K.1996 A simplified method for the analysis of hydroxyprofine in biological tissuses.Clin Biochem 29(3):225～229.

　　5，Mitchell,A.D.,I.E.P. Taylor.1970 The spectrophometric determination of hydroxyproline:An analytical investigation.Analyst 95:1003～1005.

收稿日期：1998-11-23