日本血吸虫成虫及虫卵可溶性抗原的早期诊断分子筛选
寄生虫与医学昆虫学报 2000年第1期第7卷 著 述
作者：周晓红 陈晓光 冯明钊 李华 刘国章
单位：周晓红（第一军医大学寄生虫学教研室，广州 510515）；陈晓光（第一军医大学寄生虫学教研室，广州 510515）；冯明钊（香港中文大学生物系，香港）；李华（第一军医大学寄生虫学教研室，广州 510515）；刘国章（第一军医大学寄生虫学教研室，广州 510515）
关键词：日本血吸虫病；早期诊断；可溶性虫卵抗原；可溶性成虫抗原
摘要 为获取有效的日本血吸虫病早期诊断靶抗原分子。以感染前和感染后2周、4周、6周兔混合血清以及急性、慢性日本血吸虫病人和正常人血清，用Western blot对日本血吸虫成虫可溶性抗原(AWA)和虫卵可溶性抗原(SEA)进行了全面的分析与筛选。SEA140kDa和AWA54kDa、21kDa、20kDa分子出现最早，能被感染后2周兔血清所识别；SEA69kDa、50kDa、45kDa、38kDa和AWA72kDa、45kDa、34kDa、15kDa相继能被感染后4周兔血清所识别；其中SEA140kDa、50kDa、45kDa、38kDa和AWA34kDa、21kDa、54kDa、15kDa与病人血清反应同6周兔血清反应效果相仿，均为免疫反应主带，且在SDS-PAGE上有对应的蛋白主带，具有潜在的早期诊断价值。进一步对SEA进行抗体类型的分析，发现SEA能刺激机体产生IgG、IgM和IgA反应，其中SEA50kDa、45kDa、38kDa三个抗原分子均能被IgG、IgM、IgA三种抗体所识别，且均为反应主带；SEA140kDa以IgM反应带最深；SEA100 kDa反应带仅出现于病人血清，以IgM反应最强，且其与IgM反应带在急性病人血清明显深于慢性病人血清，表明针对IgM的SEA 100kDa分子也具有一定的早期诊断和区分病程的价值。SEA140kDa、50kDa、45kDa、38kDa和AWA34kDa、21kDa、54kDa、15kDa和针对IgM的SEA100kDa分子是具有潜在早期诊断价值的优势靶抗原分子。
SCREENING OF EARLY DIAGNOSTIC MOLECULES OF
THE SOLUBLE ADULT WORM ANTIGEN (AWA) AND SOLUBLE EGG
ANTIGEN (SEA) OF SCHISTOSOMA JAPONICUM
Zhou Xiaohong
（The First Military Medical University,Guangzhou 510515）
Chen Xiaoguang
（The First Military Medical University,Guangzhou 510515）
Feng Mingzhao
（Department of Biology,Hongkong Chinese University）
Li Hua
（The First Military Medical University,Guangzhou 510515）
Liu Guozhang
（The First Military Medical University,Guangzhou 510515）
Abstract In order to obtain the effective early target antigen molecules of Schistosoma japonicum for immunodiagnosis. The soluble adult worm antigen (AWA) and soluble egg antigen (SEA) of Schistosoma japonicum have been screened and analyzed using Western blot with sera of rabbits before and 2W,4W,6W after infection and sera of acute,chronic Schistosomiasis patients and normal human beings. SEA 140kDa and AWA 54,21,20kDa molecules appeared earliest,and could be recognized by rabbits sera after 2W infection. Reactions to SEA 69,50,45,38kDa and AWA 72,45,34,15kDa antigens appeared 4W post infection. Among these early antigens,SEA 140,50,45,38kDa and AWA 34,21,54,15kDa molecules reacted with both Schistosomiasis patients sera and rabbits sera after 6W infection. These eight antigens caused strong immune response and showed themselves to be main protein bands by SDS-PAGE. It suggested that these eight molecules would be potential early antigens for immunodiagnosis. Further experiments to analysis immunoglobulin type response against SEA revealed that SEA could stimulate body to produce IgG and IgM and IgA antibodies. SEA 50,45,38kDa molecules induced strong IgG and IgM and IgA responses while SEA 140kDa predominantly resulted in IgM respones. Only reacted with patients sera and resulted in predominant IgM response,SEA 100kDa band against IgM of acute Schistosomiasis patients sera was obvious darker than that of chronic Schistosomiasis patients sera. This showed that the anti-IgM-SEA 100kDa antigen might have the potential early immunodiagnostic value. SEA 140,50,45,38kDa and AWA 34,21,54,15kDa and Anti-IgM-SEA 100kDa of Schistosoma japonicum were the potential early diagnostic molecules.
Key words Schistosomiasis japonicum Early diagnosis Soluble adult worm antigen Soluble egg antigen
血吸虫病对宿主最大的危害来自虫卵所致的肉芽肿病变。日本血吸虫成虫约24d开始产卵，约4周时肝组织内发现虫卵，5周尚未形成虫卵肉芽肿病变，至6周时肝脏形成虫卵结节(施光峰等，1994)。若能在6周前尚未发生严重病变时即进行诊断，早查早治，则能及时地阻断血吸虫病的发生发展，从而达到保护宿主的目的。目前，国内外均有有关血吸虫病早期诊断方面的研究报道，但国内对日本血吸虫尚无系统而深入的早期诊断研究报道。本研究全面分析和筛选了日本血吸虫AWA和SEA，并初步鉴定了SEA的IgG、IgM、IgA三种抗体类型所识别的靶抗原，以期筛选出具有早期诊断价值的优势靶抗原分子，为今后的现场应用打下良好的工作基础。
1 材料与方法
1.1 动物来源
1.1.1 日本血吸虫感染阳性钉螺 江苏省血吸虫病防治研究所提供。
1.1.2 成年新西兰纯种白兔 2kg～3kg/只，第一军医大学动物实验中心提供。
1.2 血清来源
1.2.1 急性日本血吸虫病人血清、慢性日本血吸虫病人血清 湖南医科大学寄生虫学教研室汪世平教授惠赠。
1.2.2 正常人血清 广州市血液中心提供广东籍义务献血员正常血清，并经血吸虫ELISA试剂盒检测阴性。
1.2.3 正常兔血清 兔感染前耳静脉采血。
1.2.4 感染兔血清 兔尾蚴攻击感染后2周、4周自耳静脉采血，6周自颈动脉放血。
1.3 主要试剂
1.3.1 HRP标记的羊抗人IgG、IgM、IgA和羊抗兔IgG 北京天象人生物工程公司提供。
1.3.2 Ap标记的羊抗人IgG和羊抗兔IgG 美国Promega公司提供。
1.3.3 PVDF膜 美国Minipore公司提供。
1.4 抗原的制备
1.4.1 日本血吸虫AWA的制备 新西兰白兔10只，以常规方法感染1 000～1 500条日本血吸虫尾蚴，于感染后42d～45d剖杀，采用心脏灌注法收集成虫。新鲜活虫立即用生理盐水漂洗3次后，收集分装置-20℃备用。取出成虫加适量灭菌生理盐水，于匀浆器中冰浴匀浆10min，再超声粉碎15min(output20，强度6，在冰浴条件下)，4℃冷浸48h，4℃ 10 000r/min离心1h，取上清即AWA，分装后-20℃冻存备用。
1.4.2 日本血吸虫可溶性虫卵抗原(SEA)的制备 新西兰白兔感染同上，SEA制备方法参见汪世平(1995)。
1.5 SDS-PAGE和ELIB
参照Ruppel等(1985)方法进行。分离胶采用12%单一浓度胶。对AWA和SEA进行ELIB分析时，所用急慢性日本血吸虫病人血清和正常人血清以及感染前和感染后2周、4周、6周兔血清均为10份混合；加二抗时，HRP标记的羊抗人IgG、IgM、IgA和羊抗兔IgG均以1：200稀释，Ap标记的羊抗人IgG和羊抗兔IgG均以1：5 000稀释；HRP标记的二抗用DAB系统显色，Ap标记的二抗用NBT/BCIP系统显色。
1.6 分子量的测定
用英国UVP公司生产的GDS-7500 型凝胶图像分析系统进行。
2 结果
2.1 AWA和SEA的SDS-PAGE结果(图1)
图1 AWA和SEA的SDS-PAGE分析
Fig.1 Coomassie brilliant blue R250 staining of AWA and SEA after SDS-PAGE
1.SEA 2.4.AWA 3.Marker
SEA出现140kDa、84kDa、57kDa、50kDa、46kDa、38kDa、36kDa、30kDa、27kDa、18/17kDa、14kDa、12/11kDa 12条蛋白主带和114kDa、67kDa等多条次带；AWA出现74kDa、67kDa、54/55kDa、45kDa、38kDa、36kDa、34kDa、32kDa、26/28kDa、21kDa、20kDa、19kDa、18kDa、15kDa、13kDa、11kDa 16条主带，还有97kDa等多条次带。
2.2 AWA和SEA的ELTB分析(图2、3，表1)
图2 SEA的免疫印迹分析
Fig.2 Western blot analysis of SEA with infected and normal rabbit sera &
acute and chronic Schistosomiasis patients and normal human sera
a.Marker；b.c.d.Anti-human IgG；e.f.g.Anti-human IgM；h.i.j.Anti-human IgA；
k.l.m.n.Anti-rabbit IgG；b.e.h. Acute Schistosomiasis patient sera;c.f.i.Chronic
Schistosomiasis patient sera;d.g.j.Normal human sera control;k. Normal rabbit sera control;
l. 2W infected rabbit sera；m.4W infected rabbit sera；n.6W infected rabbit sera
图3 AWA的免疫印迹分析
Fig.3 Western blot analysis of AWA with infected and normal rabbit sera &
acute and chronic Schistosomiasis patients and normal human sera
1. Marker；2.3.4.5.Anti-rabbit IgG；6.7.8.Anti-human IgG；2.Normal rabbit sera control；
3.2W infected rabbit sera；4.4W infected rabbit sera；5.6W infected rabbit sera；
6.Acute Schistosomiasis patient sera;7.Chronic Schistosomiasis patient sera;8.Normal human sera control
表1 不同血清与AWA和SEA的免疫印迹反应区带分子分布
Tab.1 Distribution of the molecular bands of AWA & SEA reacted
with different sera sera by Western blot
| 血清(Serum) |
AWA(kDa) |
SEA(kDa) |
| 感染后2周兔血清 |
54,21,20, |
140 |
| Rabbits sera after 2W infection |
|
| 感染后4周兔血清 |
72,54,45,34,21,20,15 |
140,69,50,45,38 |
| Rabbits sera after 4W infection |
|
| 感染后6周兔血清 |
97,72,54,45,38,34,30/ |
140,80,69,56,50,45,42,38, |
| Rabbits sera after 6W infection |
28/26,21,20,15 |
36/35,34,32,27,26 |
| 急性病人血清 |
97,72,54,45,38,34,30/ |
140,100,80,69,56,50,45,42, |
| Acute infection patients sera |
28/26,21,20,15 |
38,36/35,34,27,26 |
| 慢性病人血清 |
97,72,54,45,38,34,30/ |
140,100,80,69,56,50,45, |
| Chronic infection patients sera |
28/26,21,20,15 |
42,38,36/35,34,27,26 |
AWA和SEA分别与感染前及感染后2周、4周、6周兔血清以及与正常人和急性、慢性病人血清进行ELTB识别，结果如下：
2.2.1 AWA出现10条免疫反应主带。AWA54kDa、21kDa、20kDa抗原出现最早，能被感染后2周兔血清所识别，且与4周、6周兔血清反应后带明显加强；34kDa、15kDa、45kDa、72kDa抗原于4周开始出现较强的反应带，其中以34kDa抗原反应带最浓，呈现明显的优势，6周时反应加强；6周后26/28/30kDa，38kDa出现很深的识别带，97kDa出现反应带；6周兔血清与急性、慢性病人血清所识别带基本相同，仅各带的强弱反应程度有所差别。在人血清，97kDa、54kDa、38kDa、34kDa、21kDa呈优势反应，其中38kDa与97kDa抗原在人血清中的反应明显深于兔血清，而45kDa则在兔血清反应明显强于病人血清。
2.2.2 SEA出现13条免疫反应带，详见表1。SEA早期反应抗原明显较AWA少，且在早期反应均较AWA弱，在感染后6周反应加强。140kDa抗原为SEA最早出现反应的抗原分子，能被感染后2周兔血清所识别，且与4周、6周兔血清反应后带逐步加深。69kDa、50kDa、45kDa、38kDa抗原分子能被感染后4周兔血清所识别，但反应均较弱，6周时反应很强。SEA与病人血清和感染兔血清的反应有所差别，在140kDa～80kDa分子间的抗原与兔血清不反应，而在病人血清中该区段抗原反应性较好，其中100kDa分子呈优势。在对SEA进行抗体类别分析时发现，SEA能刺激机体产生较强的IgG、IgM反应，IgA相对弱些，其中50kDa、45kDa、38kDa三个抗原分子均能被IgG、IgM、IgA三种抗体所识别，且均为反应最浓带；100kDa反应带仅出现于病人血清，以IgM反应最强，IgG次之，IgA无反应，且其与IgM反应带在急性病人血清明显深于慢性病人血清；140kDa也以IgM反应带最深，IgG次之，IgA无反应。
3 讨论
3.1 血吸虫AWA的早期诊断靶抗原分子的分析与探讨
目前，有关血吸虫AWA的Western blot分析，在国内外均有较多报道，各家报道结果虽有所不同，但研究的焦点仍在几个重要的分子上，如AWA31/32kDa、26/28kDa、97kDa等。AWA31/32kDa分子在血吸虫病的诊断方面占有瞩目的地位，其具有血吸虫虫种特异性，可用于诊断曼氏、日本和埃及三种血吸虫病。Sm31/32kDa和Sj32kDa均已重组表达成功。Ruppel A.等(1985)曾报道SmAWA31kDa能被感染后4周小鼠血清所识别。曾庆仁等(1992)研究证实SjAWA31kDa有一定的早期诊断意义。本研究发现SjAWA34kDa分子能与感染4周后兔血清出现强反应带，是具有良好早期诊断价值的靶抗原，并经多次实验结果证实AWA34kDa分子有着非常好的重复性与特异性，且免疫反应性很强，类似上述优势诊断蛋白AWA31/32kDa分子。Evengard B.等(1990)发现针对IgG1的Sm AWA 32kDa～35kDa可作为血吸虫早期感染的标志。Mikhail M.M.等(1997)报道，Sm AWA 31/32kDa、34/35kDa分子能被2周、3周感染鼠血清所识别。这些实验结果很相似却又不尽相同，即无论是在曼氏血吸虫还是在日本血吸虫，AWA31kDa～35kDa分子区间存在着1～2个早期诊断优势抗原，但两个虫种间的早期抗原是否一致?不同实验室报道的抗原分子量差异，是由于实验条件的差异所致，还是由于抗原本身的不同?均有待进一步的实验研究证实。
本研究筛选SjAWA时发现：SjAWA54kDa、21kDa、20kDa抗原出现反应最早，能被感染后2周兔血清所识别；SjAWA34kDa、15kDa、45kDa、72kDa抗原于4周开始出现反应；6周后26/28/30kDa、38kDa、97kDa出现较深的识别带。在与急慢性病人血清的反应中，SjAWA97kDa、54kDa、38kDa、34kDa、21kDa呈优势反应，结合SDS-PAGE和与感染兔血清反应出现的时间综合分析，本文将SjAWA34kDa、21kDa、54kDa、15kDa分子抗原列为SjAWA中具有潜在早期诊断价值的靶抗原分子。
3.2 血吸虫SEA的早期诊断靶抗原分子的分析与探讨
国外报道较多的曼氏血吸虫CEF6(cation exchange fraction 6)抗原，为SmSEA用阳离子交换色谱法分离纯化所得到的纯化片段，是导致环卵沉淀现象产生的重要成份之一。将SmCEF6用于ELISA，较SEA显著提高了敏感性和特异性，且有较好的疗效考核价值(Dune DW et al.,1988)。朱荫昌等(1996)证实纯化的SjSEA107kDa～121kDa抗原有较好的疗效考核价值。而有关SEA早期诊断方面的研究尚未见报道。
本研究发现：SjSEA早期反应抗原明显较SjAWA少，且在早期反应均较AWA弱，在感染后6周反应加强。140kDa抗原为SEA最早出现反应的抗原分子，能被感染后2周兔血清所识别，且与4周、6周兔血清反应后带逐步加深。69kDa、50kDa、45kDa、38kDa抗原分子能被感染后4周兔血清所识别，但反应均较弱，6周时反应很强。国内外均有报道证实检测血吸虫特异性的IgM、IgA抗体具有一定的早期诊断价值(Valli et al.,1997)。本研究结果表明：SjSEA 38kDa、45kDa、50kDa均能被IgG、IgM、IgA三种抗体所识别；SjSEA140kDa与IgM呈优势反应；SjSEA100kDa反应带仅出现于病人血清，以IgM反应最强，且其与IgM反应带在急性病人血清明显深于慢性病人血清。结合SDS-PAGE结果综合分析，SEA 140kDa、50kDa、45kDa、38kDa和针对IgM的SEA100kDa分子是SjSEA中具有潜力的早期诊断靶抗原。
全军九五重点科研课题资助项目
参考文献
1，朱荫昌，华万全，刘韵娟.1996.日本血吸虫虫卵组分抗原疗效考核价值的研究.中国血吸虫病防治杂志，8(6)：321.
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8，Ruppel,A.,U. Breternitz,R.Burger 1985 Immunoblot analysis of Schistosoma mansoni antigens with sera of Schistosomiasis patients:diagnostic potential of an adult Schistosome polypeptide. Clin. Exp. Immunol. 62：499～504.
9，Ruppel,A.,U.Rother,H.Vongerichten et al. 1985 Schistosoma mansoni: Immunoblot analysis of adult worm proteins. Exp. Parasitol. 60：195.
10，Valli,L.C.,H.Y.Kanamura,R.M.Da Silva et al. 1997 Efficacy of an enzyme-linked immunosorbent assay in the diagnosis of and serologic distinction between acute and chronic Schistosoma mansoni infection. Am. J. Trop. Med. Hyg. 57：358～362.
收稿日期：1998-11-10
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