日本血吸虫病小鼠脏器Th2相关淋巴因子的动态定位

中华传染病杂志 1999年第1期第17卷 论著

作者：曾令兰　罗端德　刘薇　郭劲松

单位：430022　武汉，同济医科大学附属协和医院传染病教研室

关键词：血吸虫病，日本；白介素-4；白介素-5；白介素-10

　　【摘要】　目的　了解感染日本血吸虫后小鼠不同脏器Th2相关因子介导的免疫反应。方法　采用ABC免疫组化法，并用多媒体病理图文定量分析，动态研究感染后IL-4，IL-5，IL-10的变化。结果　在感染小鼠肝脏IL-4，IL-5，IL-10明显高于正常对照(P＜0.01)，并随感染时间的延长而逐步升高；在脾脏IL-4，IL-5，IL-10亦升高，但其幅度明显较肝脏为低；在结肠IL-4，IL-5，IL-10随感染时间延长呈缓慢升高趋势。结论　感染日本血吸虫病的小鼠，肝脏是Th2相关因子免疫应答的主要器官；脾脏是调节免疫的器官；而结肠Th2相关因子的升高可能是整体反应的一部分。

The dynamical and localizable study on Th2 related cytokines in the viscera of mice infected by schistosome japonicum

ZENG Linglan, LUO Duande, LIU Wei, et al.

　　Department of Infectious Diseases, Union Hospital, Tongji Medical University, Wuhan 430022

　　【Abstract】　Objective　To understand the immume reaction involved by Th2 related cytokines in different viscera of mice infected by schistosome japonicum.Methods　ABC immunohistochemical stain technique and multimedia pathologic pictures analysis were used. Meanwhile, the dynamical changes of IL-4,IL-5 and IL-10 of infected mice were studied.Results　In the livers of infected mice, IL-4,IL-5 and IL-10 were obviously higher than that of normal control (P＜0.01). It gradually increased with prolongated infection time. In the spleens of infected mice, IL-4,IL-5 and IL-10 were also elevated. However, their ranges were obviously lower than those in livers. In the colons of infected mice, IL-4,IL-5 and IL-10 slowly increased with prolongated infection time. Conclusion　In the mice infected by schistosome japonicum, the immune response of Th2 related cytokines took place mainly in the liver. The spleen played a role of immune regulation. As for colons, the increase of Th2 related cytokines may be only represented a part of immune reaction in whole body.

　　【Key words】　Schistosomiasis japonica　　Interleukin-4　　Interleukin-5　　Interleukin-10

　　大量研究表明，血吸虫病的病理变化主要是宿主免疫应答的反映，其中T辅助细胞Th1和Th2两类相关淋巴因子起着重要作用。Th2相关淋巴因子包括IL-4，IL-5和IL-10，它们之间的相互作用与血吸虫肝脏肉芽肿的形成和肝纤维化有密切关系^［1］，同时虫卵还沉积于结肠，引起局部的免疫反应，而脾脏是一个主要的免疫器官，它调节体内IL-4，IL-5和IL-10的变化，对于它们的作用国外学者在曼氏血吸虫方面作了一些工作，但对日本血吸虫方面的研究，作者尚未见到有关报道，对此我们进行了探讨，现报道如下。

　　材料和方法

　　一、实验动物

　　40只健康昆明小鼠，每只重28克左右，随机分为4组，即感染8周，10周，12周和对照组。感染组为湖北钉螺逸出的尾蚴(中国大陆株日本血吸虫)，每只小鼠接种25条，于感染后的相应天数颈椎脱臼处死，取肝，脾，结肠，置液氮中保存备用。

　　二、免疫组化检测

　　采用免疫组化ABC法(ABC试剂盒购自Vector,USA)。将液氮保存的组织冰冻切片，吹干后用纯丙酮固定，室温干燥，用1.5%双氧水/甲醇室温下作用10分钟，以灭活内源性过氧化酶。PBS稀释正常马血清(1∶50)，室温20分钟。再分组加入第一抗体IL-4(1∶25 PBS稀释，加1%BSA，下同)，IL-5(1∶25)，IL-10(1∶50)(以上兔抗鼠多抗购自Innogenetics公司)，4°C饱和湿度过夜，次日用PBS洗2次×5分钟，加入1∶200稀释的生物素化的羊抗兔IgG，37°C30分钟，PBS洗2次×5分钟，用混合的A∶B液(3∶2)37°C作用30分钟，PBS洗2×5分钟，加3，3-二氨基联苯胺(DAB)显色5～10分钟，清水洗净，甘油明胶封片，观察结果。阴性对照组采用PBS代替第一抗体，余步骤与上相同。

　　三、定量分析

　　用MPZAS-500多媒体彩色病理图文分析系统，每张病理片随机至少取100个点，计算平均积分光度。

　　结果

　　一、定位观察

　　(一) 肝脏　8周即可见肝脏表面有成串的虫卵结节，12周呈弥漫性分布。肝内IL-4，IL-5，IL-10可见到分布于细胞内和细胞外，前者位于Th2分泌细胞的胞浆内，后者位于细胞外间质，无固定形态。Th2阳性细胞主要分布于虫卵肉芽肿外层，可包绕整个肉芽肿，内层Th2阳性细胞较少，散在分布，有时可见Th2阳性物质位于卵壳上(图1)。

1　感染小鼠第10周肝脏IL-4的分布，以虫卵为中心形成的肉芽肿，外层环状分布大量的IL-4阳性细胞　10×10

　　(二) 脾脏　8周可见部分小鼠脾脏水肿，12周更加明显。Th2阳性反应率较肝脏明显减低，Th2阳性细胞呈散在分布，Th2阳性物质以块状形式主要分布在红髓区(图2)。

2　感染小鼠第10周脾脏IL-10的分布，仅有少数IL-10阳性细胞和阳性块状物质分布在红髓区　10×10

　　(三) 结肠　10周可见散在的虫卵结节，12周呈堆积状。Th2阳性反应率亦明显低于肝脏，阳性物质呈散在和聚散分布两种形式，虫卵外壳上有明显的Th2阳性反应(图3)。

3　 感染小鼠第10周结肠IL-5的分布，虫卵外壳上显示IL-5反应阳性，另有稀疏分布的IL-阳性物质　10×10

　　二、定量观察

　　血吸虫感染后小鼠肝脏，脾脏，结肠IL-4，IL-5，IL-10定量动态观察见表1～3。

表1　小鼠肝脏IL-4、IL-5、IL-10积分光度的动态观察()

　　^*与正常组比较P＜0.01

表2　小鼠脾脏IL-4、IL-5、IL-10积分光度的动态观察()

　^*与正常组比较P＜0.05

表3　小鼠小肠IL-4、IL-5、IL-10积分光度的动态观察()

　^*与正常组比较P＜0.05,^**P＜0.01

　　在肝脏感染后的第8周Th2相关因子明显升高，一直持续至12周，其中IL-4升高最为明显。在脾脏Th2相关因子的升高明显低于肝脏。在结肠Th2亦呈缓慢升高趋势。

　　三、阴性对照组

　　Th2细胞检测为阴性。

　　讨论

　　CD4⁺Th幼稚前体细胞(Thp细胞)再次受抗原刺激后分化，并表达IL-4，IL-5，IL-6和IL-10细胞因子(但不包括IFN-γ和IL-2)，引起Th2免疫应答，Th2细胞可促进其它细胞群的增长，如嗜碱性粒细胞，肥大细胞，嗜酸性粒细胞，这些细胞也可产生Th2相关细胞因子^［2］。IL-5诱导已激活的B细胞或在体内被抗原免疫的B细胞，使之增殖分化和产生IgM及IgG。IL-10最主要的抑制效应是抑制Th1细胞合成IFN-γ，后两类细胞因子均受IL-4的调控，因为用抗IL-4的单克隆抗体处理感染曼氏血吸虫病的小鼠，其IL-4，IL-5，IL-10同时降低^［3］。Wahl等^［4］也认为血吸虫可溶性虫卵抗原诱导IL-4合成，促进占优势的Th2细胞聚集，释放IL-5和IL-10。我们的实验证明感染日本血吸虫小鼠肝脏IL-4升高最为明显，从第8周起就高于IL-5和IL-10，并将这最高的趋势保持到10周和12周，在Th2相关淋巴因子中，感染小鼠的IL-4最高，IL-10次之，IL-5最低，但无论哪一种淋巴因子都远远高于正常对照。以8周为例，IL-4，IL-5，IL-10分别为正常的16、8.7和11倍。Chensue等^［5］认为对虫卵肉芽肿的形成Th1和Th2两类细胞因子有交叉调节作用，使用抗IFN的单抗，IFN和TNF减少，IL-4和IL-10增加。由于IL-4，IL-10增高抑制了IFN-γ合成，而IFN-γ能抑制贮脂细胞活化，减少胶原纤维连接蛋白的mRNA的表达，并可能有对抗虫卵肉芽肿的炎性反应，减少细胞外基质的分泌和沉积，抑制肝纤维化的作用^［6］。因此Th2相关因子的增高在血吸虫肝脏肉芽肿形成及以后肝纤维化的发展中起重要作用。

　　日本血吸虫病的早期病变主要为肝与结肠引起的肉芽肿。我们的实验证明肝脏肉芽肿附近Th2阳性反应最为强烈，并明显高于脾脏和结肠。因而推论肝脏是Th2免疫应答反应的主要场所，Chensue等^［5］曾在曼氏血吸虫感染小鼠做过局部肉芽肿的培养，IL-4和IL-10等8周升高，第20周消退，和我们的观察相一致；在脾脏，Cook等^［7］曾作过试验，感染曼氏血吸虫病小鼠和未感染者脾细胞Th2相关因子的水平均较低，仅IL-10 mRNA占优势，在未感染鼠中丝裂原刺激脾细胞可表达IL-4 mRNA，但没有IL-5 mRNA表达，在感染鼠可检测到IL-5。我们的结果亦认为脾脏不是产生Th2相关因子的主要场所，它在免疫应答反应中起调节作用，而结肠同样不是Th2相关因子产生的主要场所，它们的缓慢升高可能是整体机能免疫应答反应的一部分。

　　本课题受湖北省血吸虫病防治委员会课题基金资助(1994-19)

　　参考文献

　　1　Cheever AW, Finkelman FD, Cox TM. Anti-interleukin-4 treatment diminishes secretion of Th2 cytokines and inhibits hepatic fibrosis in murine schistosomiasis japonica. Parasite Immunol, 1995, 17:103-109.

　　2　Pearce EJ. 血吸虫病的IL-4.国外医学寄生虫病分册，1997，24：210-211.

　　3　Cheever AW, Williams ME, Wynn TA, et al. Anti-IL-4 treatment of schistosoma mansoni-infected mice inhibits development of T cells and non-B, non-T cells expressing Th2 cytokines while decreasing egg-induced hepatic fibrosis. J Immunol, 1994, 153:753-759.

　　4　Wahl SM, Frazier-Jessen M, Jin WW, et al. Cytokine regulation of schistosome-induced granuloma and fibrosis. Kidney Int, 1997, 51:1370-1375.

　　5　Chensue SW, Warmington KS, Ruth J, et al. Cross-regulatory role of interferon-gamma(IFN-gamma),IL-4 and IL-10 in schistosome egg granuloma formation: in vivo regulation of Th activity and inflammation. Clin Exp Immunol, 1994, 98:395-400.

　　6　贺永文，刘薇，曾令兰，等.γ-干扰素对血吸虫病小鼠肝纤维化的影响.中华医学杂志，1996，76：371-374.

　　7　Cook GA, Metwail A, Blum A, et al. Lymphokine expression in granulomas of schistosoma mansoni-infected mice. Cell Immunol, 1993, 152:49-58.

(收稿：1998-03-19　修回：1998-07-20)