血吸虫病肝纤维化过程中肝脏前胶原mRNA的表达变化研究
中华传染病杂志 1999年第3期第17卷 论著
作者：施光峰 徐肇玥 翁心华 朱运松
单位：施光峰、徐肇玥、翁心华 200040 上海医科大学华山医院传染病学教研室；朱运松 上海医科大学分子遗传学研究室
关键词：血吸虫病；肝硬化；α1(Ⅰ)前胶原mRNA；α1(Ⅲ)前胶原mRNA；α1(Ⅵ)前胶原mRNA
【摘要】 目的 阐明血吸虫病肝纤维化过程中，肝脏前胶原基因表达的动态变化规律。方法应用Northern核酸分子杂交技术，检测血吸虫感染小鼠在肝纤维化过程中肝脏前胶原mRNA表达量的变化。结果 小鼠感染血吸虫后6周时，肝内α1(Ⅰ)和α1(Ⅲ)前胶原mRNA的表达量即有显著增加，8周时，α1(Ⅰ)前胶原mRNA的表达量已达高峰，α1(Ⅲ)和α1(Ⅵ)前胶原mRNA的表达高峰在10周时出现。12～16周时，三者的表达量略有下降，20周时均又回升。在整个肝纤维化过程中，α1(Ⅰ)前胶原mRNA呈优势表达，α1(Ⅲ)前胶原mRNA次之，α1(Ⅵ)前胶原mRNA的表达量较前二者稍低，但其表达水平的增幅最大。结论 肝脏前胶原mRNA表达水平的检测能敏感地反映肝纤维化的趋向，α1(Ⅵ)前胶原mRNA的表达在肝纤维化形成中可能起重要作用。
Study on the expression of hepatic procollagen mRNA in Schistosomiasis with liver fibrosis
SHI Guangfeng, XU Zhaoyue, WENG Xinhua, et al.
Department of Infectious Diseases, Huashan Hospital, Shanghai Medical University, Shanghai 200040
【Abstract】 Objective To explore the dynamics of hepatic procollagen gene expression in the course of schistosomiasis with liver fibrosis.Methods Northern blot hybridization analytical technique was used to observe the dynamic changes of the content of liver procollagen mRNA in the course of liver fibrosis in mice infected with Schistosoma japonicum.Results The expression of α1(Ⅰ) and α1(Ⅲ) procollagen mRNA in the liver of mice was enhanced obviously at the 6th week after infection, and the content of α1(Ⅰ) mRNA reached to the peak at the 8th week. The content of α1(Ⅲ) and α1(Ⅵ) procollagen mRNA both reached to their peak at the 10th week. The mRNA levels of all three procollagens were decreased gradually at the 12～16th week but rose again at the 20th week. The expression of α1(Ⅰ) procollagen mRNA was the most predominant one among the three in the course of liver fibrosis. The content of α1(Ⅲ) procollagen mRNA ranks next to α1(Ⅰ) and that of α1(Ⅵ) procollagen mRNA was a little less than the other two, but its increment was much higher than the two others.Conclusion Detection of the content of hepatic procollagen mRNA could sensitively reflect the trend of liver fibrosis, and the expression of α1(Ⅵ) procollagen mRNA maybe play an important role in the pathogenesis of liver fibrosis.
【Key words】 Schistosomiasis Liver cirrhosis α1(Ⅰ) procollagen mRNA α1(Ⅲ) procollagen mRNA α1(Ⅵ) procollagen mRNA
日本血吸虫感染所引起的肝纤维化仍然危害着我国人民的身体健康。业已明确，肝纤维化的特征是肝细胞外基质(ECM)，尤其是胶原的过度增生和异常沉积［1］。然而，血吸虫病肝纤维化过程中，肝脏前胶原mRNA的表达及表达水平的定量分析研究，至今作者尚未见国内报道。我们建立日本血吸虫感染小鼠肝纤维化动物模型，观察肝脏α1(Ⅰ)、α1(Ⅲ)、α1(Ⅵ)前胶原mRNA的表达变化，现将结果报告如下。
材料与方法
一、小鼠肝纤维化模型的建立
ICR小鼠，雌性，16～18g，共80只，由中国科学院上海实验动物中心供给。将其分为两组：(1)感染组(60只)：每鼠经腹部皮肤人工感染日本血吸虫尾蚴25条，于感染后6、8、10、12、16和20周分别剖杀10只小鼠，取其肝脏。血吸虫尾蚴由上海市寄生虫病防治研究所提供。(2)正常对照组(20只)：小鼠不感染血吸虫尾蚴，与感染组相同时间分别剖杀4只小鼠，取其肝脏，作为正常对照。分别将肝组织一部分直接入液氮速冻，-70°C贮存，用作Northern印迹杂交，另一部分置于缓冲福尔马林固定，作常规石蜡切片，HE染色，用作肝组织病理学观察。
二、前胶原基因质粒
α1(Ⅰ)、α1(Ⅲ)、α1(Ⅵ)型前胶原重组质粒DNA由美国Jefferson医学院Mon Li Chu博士馈赠，其特性见表1。大肠杆菌JM109及HB101由上海医科大学分子遗传学研究室提供。限制性内切酶PstⅠ、BamHⅠ、EcoRⅠ、HindⅢ为美国Gibco BRL公司产品。
表1 前胶原基因质粒特性
| 质粒
DNA |
载体 |
酶切位点 |
探针长度 |
转化菌种 |
筛选
标记 |
| α1(Ⅰ) |
pUC18 |
Pst Ⅰ/BamHⅠ |
1.3b |
JM109 |
耐氨苄
西林 |
| α1(Ⅲ) |
pBR322 |
EcoRⅠ/HindⅢ |
0.7kb |
HB101 |
同上 |
| α1(Ⅵ) |
pBluescript |
EcoRⅠ |
2.0kb |
JM109 |
同上 |
三、前胶原mRNA Northern印迹杂交
(一) 前胶原cDNA探针的制备 参照《分子克隆实验指南》方法［2］。
(二) 肝组织总RNA的抽提 异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法［3］，以紫外分光光度计(日本岛津UV-300型)定量，测A260/A280为1.7～2.0，-70°C贮存备用。
(三) Northern印迹转移 RNA甲醛变性凝胶电泳后，按毛细管转移方法，将RNA转移至尼龙膜。
(四) 前胶原cDNA探针的标记及核酸分子杂交 以地高辛标记，按试剂盒(德国Boehringer Mannheim Co产品)说明书进行操作。
四、前胶原mRNA含量的检测
用图像扫描分析仪(Pharmacia Image Biotech)对杂交结果作积分光密度图像分析，测定各型前胶原mRNA的相对含量。样品mRNA含量=A值-本底A值。统计学分析用t检验方法。
结果
一、肝组织病理学观察
正常对照组小鼠肝组织在实验各时期均未见任何病变。感染组小鼠6周时已形成虫卵肉芽肿病变，可见典型的嗜酸性脓肿，部分虫卵肉芽肿旁可见大块坏死灶，肝窦内枯否细胞增生；感染后8周，病变达高峰，肝内布满虫卵肉芽肿病灶，主要为假结核结节，亦可见部分急性虫卵肉芽肿，炎症反应强烈，汇管区纤维结缔组织增生；10周时，虫卵肉芽肿周围有纤维增生现象，肝组织内急、慢性虫卵肉芽肿同时存在；12周时，病变已趋慢性化，较多的慢性虫卵肉芽肿病灶已纤维化(图1)；16周时肝内可见纤维疤痕形成及大量的纤维钙化虫卵结节；20周时可见大量的纤维疤痕病灶，肝细胞浊肿变性，血窦明显被压迫(图2)。
1 感染血吸虫小鼠，12周时肝组织内较多的慢性虫卵肉芽肿病灶，纤维明显增生 HE×100
2 感染血吸虫小鼠，20周时肝组织内可见较多的纤维疤痕病灶，肝细胞浊肿变性，血窦明显被压迫 HE×100
二、肝脏前胶原mRNA表达水平的动态变化
(一) 正常对照组 肝脏前胶原mRNA Northern印迹杂交结果显示，正常对照组小鼠肝脏均少量表达α1(Ⅰ)、α1(Ⅲ)和α1(Ⅵ)前胶原mRNA。图像光密度测定显示：在实验各时期，同一型前胶原mRNA的表达量基本相似，以α1(Ⅰ) mRNA的表达水平最高，α1(Ⅲ)mRNA次之，α1(Ⅵ)mRNA的表达量最低。正常对照组小鼠肝脏前胶原mRNA表达水平的动态变化见图3。
3 正常对照组肝脏α1(Ⅰ)、α1(Ⅲ)和α1(Ⅵ)前胶原mRNA表达量的动态变化曲线 (二) 感染组 小鼠感染血吸虫后形成肝纤维化时，α1(Ⅰ)、α1(Ⅲ)和α1(Ⅵ)前胶原mRNA的表达量较正常对照组均有增加，但三者的表达时相与增幅的高低有所不同。感染后6周时，α1(Ⅰ)和α1(Ⅲ)mRNA表达水平较正常对照组明显增高，而α1(Ⅵ)mRNA的表达量仍较低；8周时，三型mRNA的表达均显著增强，α1(Ⅰ)mRNA的表达量已达峰值，其表达量为正常对照组的2.6倍；10周时，α1(Ⅲ)和α1(Ⅵ)mRNA的表达量升至峰值，分别为对照组的4.3和9.7倍；12～16周时，三型前胶原mRNA的表达量均略有下降，但与正常对照组相比仍有显著差别，表明三型前胶原mRNA的表达仍处于较高水平；20周时，三型前胶原mRNA的表达量均有所回升。感染组小鼠肝前胶原mRNA表达水平的动态变化见图4。
4 感染组肝脏α1(Ⅰ)、α1(Ⅲ)和α1(Ⅵ)前胶原mRNA表达量的动态变化曲线
讨论
建立血吸虫感染动物肝纤维化模型，对我国血吸虫病肝纤维化的防治研究具有重要的现实意义和应用价值。研究发现［4］，多种动物适用于血吸虫病肝纤维化模型的建立，但感染相同数量日本血吸虫尾蚴的不同纯种小鼠，其肝纤维化程度以ICR株小鼠最明显，类似家兔及人类。本研究采用该品系小鼠，每鼠感染25条日本血吸虫尾蚴，通过肝脏病理学观察显示，已成功地建立了小鼠血吸虫病肝纤维化模型。
本研究应用Northern核酸分子杂交技术，观察了小鼠感染血吸虫后肝脏前胶原mRNA表达水平的动态变化。结果显示，小鼠肝脏形成纤维化时，α1(Ⅰ)、α1(Ⅲ)和α1(Ⅵ)前胶原mRNA的表达量均有不同程度的显著增加，但不同型胶原基因，其mRNA的表达时相有所差异。Kresina等［5］报道C57BL/6小鼠感染日本血吸虫后，α2(Ⅰ)前胶原mRNA表达量在感染后6周时有显著增加，表达高峰出现在感染后8周，与本实验结果一致。该研究还显示α1(Ⅲ)前胶原mRNA的表达高峰出现在感染后11周，以后迅速下降，并一直在低水平表达，而本研究显示α1(Ⅲ)前胶原mRNA表达水平的下降较为缓慢，实验过程中均在较高水平表达，可能是由于感染小鼠的品系不同所造成。α1(Ⅵ)前胶原mRNA表达水平的变化，在血吸虫性肝纤维化研究中，作者尚未见报道。Takahara等［6］报道用四氯化碳诱导Wistar大鼠形成肝纤维化后，α2(Ⅵ)前胶原mRNA的表达水平在急性期(3天)和慢性期(7周及14周)时均有显著升高，这可能与该模型形成肝纤维化较为迅速，四氯化碳在急性期即刺激α2(Ⅵ)前胶原基因的高效表达有关。
此外，本研究还显示肝纤维化时前胶原mRNA表达量的增加幅度在不同型胶原基因也有不同。本实验结果表明，α1(Ⅰ)前胶原mRNA在血吸虫病肝纤维化小鼠中呈优势表达，其表达量在感染后相应时期为最多，α1(Ⅲ)mRNA的表达量次之，α1(Ⅵ)mRNA的表达量较前两者稍低，但其表达水平的增幅最大，为正常对照组的9.7倍，显著高于前两者，提示α1(Ⅵ)前胶原mRNA的表达在肝纤维化时可能起重要作用。
血吸虫感染导致肝脏前胶原mRNA表达水平增高的机制，目前尚不十分清楚。一般认为，前胶原mRNA表达量的增加可能与前胶原基因的转录增强有关，也可能与稳定态mRNA增加和mRNA降解减少等因素有关［7，8］。有研究报道［9］，血吸虫感染可导致肝脏前胶原基因转录的增加，血吸虫虫卵及虫卵肉芽肿可分泌成纤维细胞刺激因子，致使肝内纤维结缔组织异常增生。因而，我们认为在实验早期(6～10周)，虫卵肉芽肿反应最为强烈，使前胶原基因转录增强，致肝脏前胶原mRNA的表达量增加。此后(12～16周)，肝内虫卵肉芽肿反应逐渐减弱，使前胶原基因转录减少，导致前胶原mRNA的表达水平也逐渐下降。但随着肝内成纤维细胞的数量增多，肝脏前胶原mRNA的表达量也随之增加，所以在实验后期(20周时)，前胶原mRNA的表达水平又有所回升。由此可见，肝脏前胶原mRNA的表达水平与肝脏病变之间有着密切关系，前胶原mRNA的表达水平在肝纤维化早期即已升高，提示它能敏感地反映肝纤维化的发展趋向。
本课题受卫生部科学研究基金资助(编号：9601191)
参考文献
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2 萨姆布鲁克，弗里奇，曼氏阿蒂期，主编.分子克隆实验指南.第2版.北京：科技出版社，1992.16-34.
3 Chomczynski P, Scchi N. Single-Step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem, 1987, 162:156-159.
4 程明亮，刘三都，主编.肝纤维化的基础研究及临床.第1版.北京：人民卫生出版社，1996.81-82.
5 Kresina TF, He Q, Zern MA, et al. Hepatic fibrosis and gene expression changes induced by praziquantel treatment during immune modulation of schistosoma japonicum infection. Parasitology, 1993, 107:397-404.
6 Takahara T, Sollberg S, Muona P, et al. Type Ⅵ collagen gene expression in experimental liver fibrosis: quantitation and spatial distribution of mRNAs, and immunodetection of the protein. Liver, 1995, 15:78-86.
7 Pierce RA, Glaug MR, Greco RS, et al. Increased procollogen mRNA levels in carbon tetrachloride-induced liver fibrosis in rats. J Biol Chem, 1987, 262:1652-1658.
8 Brenner DA, Veloz L, Vaenisch R, et al. Stimulation of the collagen α1(Ⅰ) endogenous gene and transgene in carbon tetrachloride-induced hepatic fibrosis. Hepatology, 1993, 17:287-292.
9 Weiner FR, Czaja MJ, Giambrone MH, et al. Transcriptional and posttranscriptional effects of dexamethasone on albumine and procollagen messenger RNAs in murine schistosomiasis. Biochemistry, 1987, 26:1557-1562.
(收稿：1998-10-09 修回：1999-03-24)
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