流行性乙型脑炎Vero细胞纯化灭活疫苗的研究

中华实验和临床病毒学杂志 1999年第2期第13卷 论著

作者：姚智慧　董关木　俞永新

单位：100050　北京　中国药品生物制品检定所

　　关键词: 流行性乙型脑炎；Vero细胞；疫苗；弱毒株

　　【摘要】　目的　研制新的流行性乙型脑炎传代细胞疫苗。方法　将流行性乙型脑炎弱毒株SA_14-14-2适应于Vero细胞，作纯化灭活疫苗，比较不同培养方法病毒在Vero细胞的增殖规律，对病毒的浓缩和纯化条件进行研究，并将所制备的疫苗按不同蛋白浓度免疫动物。结果　发现普通转瓶培养，可长时间维持病毒的高滴度。在感染病毒后，以无牛血清的培养基替代含牛血清的培养基，不仅可维持病毒的高滴度增殖，而且可多次收获，确立了应用8%PEG8000浓缩病毒液，15%～60%的蔗糖密度梯度超速离心纯化的工艺，每剂量为0.5 μg纯化疫苗的中和抗体水平，即可达到与现有商品疫苗相一致的滴度。结论　SA_14-14-2株制备的Vero细胞纯化疫苗，有望成为一种新的反应轻、效价高的疫苗。

　　Study on a purified and inactivated japanese encephalitis vaccine prepared on Vero cells using SA_14-14-2 attenuated virus strain　YAO Zhihui, DONG Guanmu, YU Yongxin. National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products, Beijing 100050

　　【Abstract】　Objective　To develop a kind of new Japanese Encephalitis(JE) vaccine prepared on Vero cells.Methods　A JE attenuated virus strain SA_14-14-2 was adapted on Vero cells for preparation of purified inactivated vaccine. Comparison of the growth curves of SA_14-14-2 in roller bottle and in spinner flask was made.After the virus inoculation and absorption on Vero cells for 2 hours, cultures were replaced with serum-free MEM, the culture supernatants were harvested on day 2,4,6 after inoculation. The virus fluids were pooled, concentrated by 8% PEG, and purified on 15%～60% sucrose density gradients. The purified virus was inactivated with 0.02% formalin.Results　It showed that virus titer was higher and maintained longer in roller bottle. Mice vaccinated twicely with 0.5 μg dose of the purified inactivated vaccine induced neutralizing antibody titers equal to that of the mice vaccinated with primary hamster kidney inactivated vaccine. Conclusion　This Vero cell prepared purified and inactivated JE vaccine made by SA_14-14-2 strain could be used for human as a kind of new JE vaccine.

　　 　　【Key words】　Japanese encephalitis(JE)　　Vero cells　　Vaccine　　JE attenuated virus strain

　　目前，流行性乙型脑炎尚无特殊的治疗方法，免疫接种是保护易感人群的最有效的措施^［1］。我国目前主要使用的地鼠肾细胞灭活疫苗，细胞来源于地鼠，因此需大批量饲养地鼠，不但成本高，而且疫苗未经纯化，存在一定的地鼠肾细胞残留，容易引起过敏反应。Vero细胞是一种传代细胞，除无需动物外，还可进行多次收获的大规模工业化生产，现已由WHO批准应用于疫苗的生产，国外已有商品化的狂犬病疫苗和小儿麻痹疫苗，并已列入WHO的规程^［2～4］。我们将流行性乙型脑炎弱毒株SA_14-14-2适应于Vero细胞后，进行了纯化疫苗的初步研究。

　　1　材料和方法

　　1.1　细胞　Vero细胞来自美国ATCC，由我室传代保存，基础种子库为第124代，工作种子库为第130代。用于疫苗生产的代次，不超过第160代。

　　1.2　毒株　流行性乙型脑炎弱毒株SA_14-14-2为我们研制成功的流行性乙型脑炎减毒活疫苗用毒株^［5］，将其适应于Vero细胞后，作为纯化灭活疫苗用毒株。

　　1.3　病毒在Vero细胞上的培养　将病毒滴度大于10⁷的种子毒1 ml，稀释后接种于Vero细胞已长成单层的490 cm²的转瓶中，35℃吸附2小时，然后加入无血清的MEM培养液，在35℃的孵育箱中培养。测定不同时间的病毒滴度，将滴度大于10⁷的合并液用于浓缩和纯化。

　　1.4　病毒的浓缩和纯化　将合并后的病毒液在4℃下，以6 000 r/min离心30分钟，去除细胞碎片，然后加终浓度为8%的PEG 8000(Sigma产品)和0.375 mol/L NaCl 4℃下搅拌至完全溶化，6 000 r/min离心30分钟后，取沉淀用STE(100 mmol/L NaCl, 10 mmol/L Tris-HCl, 1 mmol/L EDTA, pH7.4)缓冲液溶解，12 000 r/min离心15分钟后，将上清加在已制备好的含有15 ml蔗糖梯度(60%，55%，50%，45%，40%，35%的蔗糖均为2 ml，15%的蔗糖为1 ml)的40 ml超速离心管中，然后用SW28转子(Beckman产品)以17 000 r/min在10℃离心18小时，收获并合并SDS-PAGE检测阳性的区段。

　　1.5　SDS-PAGE　应用8%～16%的丙烯酰胺凝胶电泳，考马斯亮蓝常规染色，脱色后干燥固定。

　　1.6　病毒的灭活　采用分析纯的福尔马林(Sigma产品)作为病毒灭活剂，终浓度为0.02%。

　　1.7　蛋白含量测定　总蛋白测定应用BIO-RAD试剂盒，采用Bradford^［6］方法，应用牛血清白蛋白作为标准。

　　1.8　疫苗的制备和动物的免疫　将已灭活的病毒液，用稀释液稀释制备成不同蛋白浓度的疫苗，然后每组分别于0，14天免疫5只Balb/C小鼠，每只腹腔免疫0.5 ml，两周后收集血清合并灭活后，用于中和抗体的检测。应用卫生部长春生物制品研究所生产的地鼠肾灭活疫苗同时免疫作为对照。

　　1.9　病毒的滴定和空斑减少中和试验(PRNT)　应用Vero细胞作为基质细胞、0.8%甲基纤维素为覆盖物、结晶紫染色的方法，进行病毒的滴定和血清中和抗体的测定，参见文献［7］。

　　2　结果

　　2.1　病毒的培养和收获　比较普通转瓶和纺锤型转瓶培养不同时间的病毒繁殖动态，发现490 cm²的普通转瓶培养的病毒滴度较高，维持时间较长。同时，比较无血清和不同浓度血清培养基对病毒滴度的影响，无血清培养基可维持病毒的高滴度(表1)。进一步用转瓶培养不同时间收获病毒，发现分别于2、4、6天收获时，病毒滴度均可维持在10⁷/ml，表明无血清培养基培养病毒可以多次收获。

　　2.2　病毒的浓缩和纯化　通过对病毒的浓缩和纯化条件研究，确立了应用8%PEG 8000浓缩病毒液，15%～60%的蔗糖密度梯度超速离心纯化的工艺。纯化产物的SDS-PAGE，显示清晰的E蛋白纯化条带(图1)。

　　2.3　疫苗的制备和免疫效果　将灭活后的病毒液，经6孔板扩增传代，确定灭活完全后，再将所制备的疫苗按不同蛋白浓度免疫动物，结果每剂量为0.5 μg的纯化疫苗的中和抗体水平，即可达到与现有的商品疫苗相一致的滴度(表2)。

　　3　讨论

　　我们在研制流行性乙型脑炎减毒活疫苗成功的基础上，将弱毒株SA_14-14-2适应于Vero细胞。应用普通转瓶和纺锤型转瓶Vero细胞培养SA_14-14-2株病毒，发现普通转瓶培养可长时间维持病毒的高滴度。为减少病毒纯化过程中牛血清残余对纯化效果的影响，我们进一步应用无牛血清的培养基培养病毒的研究，结果在感染病毒后，以无牛血清的培养基替代含牛血清的培养基，不仅可维持病毒的高滴度增殖，而且可多次收获。这一结果可提高病毒收获量3倍以上，大大的降低了成本。

表1　普通转瓶和纺锤型转瓶Vero细胞培养SA_14-14-2株的生长曲线

　　Tab.1　Growth curves of SA_14-14-2 in roller bottle and spinner flask

　　注.*:490 cm²，细胞浓度为1.2×10⁸/100 ml，35℃；#：250 ml，细胞浓度为7.5×10⁸/100 ml, 35℃；A：无血清的MEM；B：2%FBS的MEM培养2天后，换无血清的MEM；C：2%FBS的MEM

　　Notes. *: 490 cm², cell concentration was 1.2×10⁸/100 ml, 35℃. #: 250 ml, cell concentration was 7.5×10⁸/100 ml, 35℃. A: sermu-free MEM. B: 2%FBS MEM 2 days, then replaced by serum-free MEM. C: 2%FBS mEM

图1　纯化产物的SDS-PAGE检测结果

　　1：蛋白分子量标准：250 000肌球蛋白，98 000牛血清白蛋白，64 000谷氨酸脱氢酶，50 000乙醇脱氢酶，36 000碳脱水酶，30 000肌红蛋白.2～9：收获片段

　　Fig.1　SDS-PAGE of purified products

　　1: Protein MW standards: 250 000 Myosin. 98 000 BSA，64 000 Glutamic dehydrogenase. 50 000 Alcohol dehydrogenase，36 000 Carbonic anhydrase，30 000 Myoglobin. 2～9: Harvested fragment

表2　SA_14-14-2 Vero纯化灭活疫苗的中和抗体反应

　　Tab.2　Neutralizing antibody titers of mice vaccinated with

　　SA_14-14-2 Vero cell prepared purified and inactivated vaccine

　　注.GHK：金黄地鼠肾细胞

　　Note. GHK: Golden hamster kidney cells　　细胞密度是病毒增殖的一个因素，我们应用纺锤型转瓶培养细胞发现，高密度的细胞并未能提高病毒的滴度，这与报道相一致^［8］。

　　参考国外制备纯化疫苗的方法^［9～11］，结合我们的经验，确立了应用PEG 8000沉淀病毒后，15%～60%的蔗糖密度梯度超速离心纯化的方法，经灭活稀释后得到纯化的疫苗。将所制备的疫苗，按不同蛋白浓度免疫动物，结果每剂量仅为0.5 μg的纯化疫苗的中和抗体水平，即可达到现有商品疫苗相一致的滴度，而高蛋白浓度的疫苗抗体水平，则较现有的商品疫苗的滴度为高，说明SA_14-14-2株制备的Vero细胞纯化疫苗，有望成为一种新的反应轻、效价高的疫苗。

　　参考文献

　　［1］自登云，陈伯权，俞永新，主编.虫媒病毒与虫媒病毒病.昆明：云南科技出版社，1995.151-163.

　　［2］Assaad F, Furesz J, Grachev V, et al. Requirements for continuous cell lines used for biological production. WHO Tech Rep Ser, 1987,747:93-103.

　　［3］Montagnon M J. Polio and rabies vaccines produced in continuous cell line. A reality for Vero cell lines. Develop Biol Standard, 1989,70:27.

　　［4］Montagnon B J, Fanget B, Vincent-Falquet J C. Industrial scale production of inactivated polioviurs vaccine prepared by culture of Vero cells on microcarrier. Rev Infect Dis 1984,6(suppl 2):314-341.

　　［5］Yu YX, Wu PF, Ao J, et al. Selection of a better immunogenic and highly attenuated live vaccine virus strain of JE. Ⅰ.Some biological characteristics of SA_14-14-2 mutant. Chin J Microbiol Immunol, 1981,1:77-83.

　　［6］Bradford M. A method for detection of protein based on dye binding. Anal Biochem 1976, 72:248-54.

　　［7］张国铭，郑铮，俞永新.流行性乙型脑炎病毒血清抗体半微量空斑抑制法的改进.病毒学报，1987，3：385.

　　［8］庞成华，石慧娟，常振彦，等.应用微载体Vero细胞制备流行性乙型脑炎灭活疫苗最佳条件的研究.中国生物制品学杂志，1993，6(4)：170-174.

　　［9］Putnak R, Barvir D A, Burrous J M, et al. Development of a purified, inactivated, dengue-2 virus vaccine prototype in Vero cells: Immunogenicity and protection in mice and Rhesus monkeys. J Infect Dis, 1996, 174:1176-1184.

　　［10］Yamashita T, Ishikawa N, Hojo F, et al. Japanese encephalitis purified vaccine. Ⅱ. Purity of the mouse brain vaccine purified by ultracentrifugation. Biken J, 1970,13:25-28.

　　［11］Heinz F X, Kunz C, Fauma H. Preparation of a highly purified vaccine against tick-borne encephalitis by continuous flow zonal ultracentrifugation. J Med Virol, 1980, 6:312-21.

(收稿：1998-03-27　　修回：1998-08-27)