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β-丙内酯在人用纯化地鼠肾细胞狂犬疫苗制备中的应用研究

β-丙内酯在用纯化地鼠肾细胞狂犬疫苗制备中的应用研究

中国兽共患病杂志 1999年第6期第15卷 实验研究

作者:刘兆文 李福安 钱 浩

单位:辽宁省卫生防疫站(沈阳,110005)

关键词:β-丙内酯;用纯化地鼠肾细胞狂犬疫苗;毛细管气相色谱法

  摘要 我们将β-丙内酯(简称BPL)用于用纯化地鼠肾细胞狂犬疫苗的灭活,虽然BPL是一种致癌物,但极易水解,用毛细管气相色谱法检测含BPL的疫苗在37℃水浴中水解0h、0.5h、1.0h、1.5h、2.0h时的含量(ppm)分别为2 62.0、70.0、13.0、5.1,未检出,结果表明疫苗中的BPL随水解时间延长,其含量逐渐变小,2h以后彻底消失,这为我们应用BPL灭活狂犬病毒所需水解时间提供了科学依据。用病毒灭活试验及病毒增殖试验的常规方法对用BPL灭活后的疫苗进行有效性实验,结果小白鼠均健康存活,这表明已无活病毒存在,灭活有效。

STUDY FOR APPLICATON OF β-PROPIOLACTONE ON PREPARATION OF

  HUMAN RABIES VACCINE OF PURIFIED HAMSTER KIDNEY CELL

Liu Zhaowen Li Fuan Qian Hao

  (Liaoning Health and Anti-epidemic Station,Shenyang,110005)

  ABSTRACT We use β-propiolactone(BPL) to inactivate human rabies vaccine of purified hamster kidney cell.Although BPL is a kind of carcino gen,it is very easy for hydrolysis.We used capillary gas chromatography method t o detect BPL content in the vaccine under the condition of 37℃ water bath for 0 h,0.5h,1.0h,1.5h and 2.0h,the resutant residue(ppm)was 262.0,70.0,13.0,5 .1 and undetection respectively.This result indicates that with the time prolongation of hydrolysis ,the content of BPL in vaccine decreases little by little and disappears thoroul y 2 hours later.It provides scientific basis for requiring time ventional method s of viral inactivation and viral proliferation to test availability of the vacc ine inactivated by BPL,the testing mice all remain live and healthy.This shows n o live virus exists and the inactivation is effective.

  KEY WORDS β-propiolactone Human rabies vaccine of purified h amster kidney cell Capillary gas chromatography method

  目前,我国制备狂犬病疫苗时采用甲醛溶液灭活,甲醛为致癌物,残留的游离甲醛随疫苗注入体后产生制激性反应。而BPL在国外已广泛用于各种疫苗的灭活。它是一种杂环类化合物(C3H4O2),沸点155℃,常温下是无色粘稠状液体,对病毒具有很强的灭活作用,其机理为改变病毒RNA结构达到灭活目的。在国内,我们首次应用BPL对用纯化地鼠肾细胞狂犬病疫苗进行灭活,疫苗通过了卫生部新药审评委员会的评审。大剂量BPL虽是一种致癌物,但极易水解,水解后形成体脂肪代谢产物β-羟基丙酸[1] ,对体无害,而水解多长时间BPL才能彻底消失,我们应用毛细管气相色谱法对BPL在37℃水浴中水解变化情况进行了跟踪检测分析。

  1 材料和方法

  1.1 用毛细管气相色谱法检测BPL含量

  1.1.1 样品处理 BPL标样(临用前配制,SIGMA公司出品,含量99.1%,批号096H0044);地鼠肾细胞狂犬病疫苗(批号970401);含BPL的地鼠肾细胞狂犬病疫苗(pH为7.6)。

  1.1.2 仪器 HP5890-Ⅱ气相色谱仪;色谱柱:HP-20M,25m×0.32mm;氢火焰检测器。

  1.1.3 色谱条件 汽化室温度160℃;柱温120℃;检测器温度280℃。

  1.1.4 方法

  1.1.4.1 取0.1μl BPL标样确定BPL出峰时间及峰面积;

  1.1.4.2 取疫苗1μl进样,确定疫苗峰位;

  1.1.4.3 将含BPL疫苗置于37℃水浴中并分别在0h、0.5h、1.0h、 1.5h、2.0h取样0.6μl,检测BPL含量。

  1.1.4.4 水解过程中BPL含量计算方法:

  1.2 病毒灭活试验及病毒增值试验均按常规方法[2]进行。

  2 结果与讨论

  2.1 毛细管气相色谱法检测BPL含量 狂犬疫苗出峰时间为1.682min,而BPL标样出峰时间为2.624min,两峰明显分开,表明BPL水解变化情况不受疫苗峰的影响,检测结果准确。疫苗在37℃水浴中水解变化情况见下表(最小检出0.1ppm[1])。

表1 疫苗在37℃水浴中水解变化情况

水解时间(h) 色谱峰位 峰面积 BPL含量(ppm)
0 2.632 30554 145.8
0.5 2.632 8415 40.2
1.0 2.630 2642 2.6
1.5 2.631 882 4.2
2.0 未出峰 - -

  结果表明随着水解时间的延长,疫苗中BPL含量逐渐变小,到水解2h以后再未检出,这为我们制备狂犬病疫苗应用BPL灭活病毒后所需水解时间提供了科学依据。此结果与文献[3,4]中规定的BPL在37℃水浴水解2h消失的结果完全一致。甲醛灭活需要近2个月,而BPL仅需过夜,从而显著地缩短了疫苗生产周期,提高了经济效益。

  2.2 灭活效果检测

  2.2.1 病毒灭活试验结果 一组10只小白鼠脑内接种灭活后的狂犬病疫苗,观察14天均健康存活。

  2.2.2 狂犬病毒扩增试验结果 一组20只小白鼠脑内接种14天和21天灭活狂犬病毒合并培养液,观察14天均健康存活。

  以上两试验结果表明加BPL的狂犬疫苗,4℃过夜,再37℃水解2h后,已无活病毒存在,灭活有效,保证了该狂犬疫苗的安全可靠。

  3 参考文献

  1.M.O.Schmita-Masse,Analyse de La β-propiolactone Par chromatogphie gaz- liquide I.REcherche d'un reside de β-propiolactone dans le Vaccin antirabique PasteurⅡ.Etude de la courbe d'hydrolyse de La β-propiolactone ápH7.4,Journa l of Chromatoyraphy,70(1972):128~134.

  2.WHO生物制品规程续编Ⅱ168-177.

  3.Singh H.Laboratory techniques in rabies(Fourth edition)WHO Geneva,1996,234~2 40.

  4.Montagnon B,et al.Laboratory techniques in rabies(Fourth edition)WHO Geneva,19 96,285~289.

1998年11月21日收稿


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