降钙素在种植窗期子宫内膜的表达及其与不孕的关系

　　同济医科大学学报2000第29卷第4期

付志红　陈士岭　邢福祺

　　摘 要：为探讨降钙素(CT)在子宫内膜中的表达规律及其与不孕的关系。运用特异单克隆抗体，采用免疫组化方法，对37份分别取自正常月经周期第7～28 d的内膜及20份不同原因不孕症患者“种植窗”期的子宫内膜，进行了CT表达的检测。结果发现：CT特异性表达于“种植窗”期子宫内膜，与正常妇女相比，输卵管阻塞性不孕患者子宫内膜中CT表达无差异，子宫内膜异位症、不明原因不孕患者子宫内膜中CT表达明显减少。提示：CT参与种植窗期子宫内膜容受性形成，CT表达异常，可能是导致不孕的重要因素。

　　关键词：子宫内膜；降钙素；不育症；女性

　　正常子宫内膜仅在一个极短的关键时期内允许胚胎着床，这一时期代表着子宫内膜接受性达到最高，被称为“种植窗”（implantation window）。在人类和啮齿动物，着床发生在 受精后4～6 d。虽然已知道“种植窗”的形成受卵巢激素的精细调控，但其分子机制还不清楚。推测：卵巢激素调节子宫内膜特定基因表达，合成新的蛋白质，使子宫内膜能接受胚胎植入。Ying-Qing Ding等^［1］ 用基因表达筛选技术(gene express screen techniqu e)分离 出小鼠“种植窗”期子宫内膜特异性增强表达的基因，DNA测序发现其中之一为降钙素(Calc it onin ，CT)，其表达与“种植窗”的开放相吻合。阻断其表达，导致着床失败，说明CT在子宫 内膜“种植窗”的形成中起重要作用。有关人类子宫内膜中CT的表达规律的研究，国内外均未见系统报道。本研究采用免疫组化技术，对正常妇女不同月经时期子宫内膜和不孕症患者子宫内膜中CT进行了研究。

　　1　资料与方法

　　1.1　研究对象

　　正常子宫内膜来自我院门诊因患阴道炎治疗后复查或上环的妇女37例，年龄25～32岁，月经周期正常（28～30 d），有正常生育史，3个月内未用任何激素类药物,分别取自周期第7～27 d。不孕症患者20例来自1999年6月至9月在我院生殖中心行体外受精-胚胎移植（IVF-ET）的不孕妇女，年龄27～36岁。其中11例为输卵管阻塞性因素，4例为子宫内膜异位症 ，5例为不明原因不孕。在月经第20～23 d行子宫内膜活检术。

　　1.2　方法

　　1.2.1　标本收集及处理：用刮匙搔刮少许子宫内膜组织，经中性福尔马林液固定，石蜡包埋切片，其中1张切片经常规HE染色，行组织学检查，确定其月经周期阶段，另2张切片行免疫组化染色备用。

　　1.2.2　检测方法：采用单克隆抗体免疫组化法，测定子宫内膜组织石蜡切片中的CT。CT抗体为美国ZYMED产品，SABC试剂盒为武汉博士德产品。Ⅰ抗为兔抗人CT单克隆抗体，Ⅱ抗 为羊抗兔IgG，Ⅲ抗为辣根过氧化酶标记的链霉素卵白素。用PBS代替Ⅰ抗作为阴性对照，阳性对照由博士德公司提供。

　　1.2.3　分组情况：根据病理检查结果将37例正常生育期妇女分为增生早期（周期第6～9 d） 7例，增生晚期（周期第10～15 d）6例，黄体早期（周期第16～19 d）8例，黄体中期（周 期第20～23 d）10例，黄体晚期（周期第24～27 d）6例。

　　1.2.4　判断标准:在高倍显微镜下(10×10)观察细胞着色情况,以细胞内出现棕黄色颗粒为阳性,空白对照为阴性,阳性对照为阳性。

　　1.2.5　半定量测定:用图像分析仪对每张切片进行半定量测定,记录所得的吸光度(A)值。

　　1.3　统计分析

　　采用方差分析进行统计学处理。

　　2　结果

　　2.1　正常妇女月经周期中子宫内膜CT表达

　　CT特异性表达于黄体中期子宫内膜腺上皮细胞浆中，黄体早期开始有表达，黄体中期达到最高，增殖期、黄体晚期均无表达。

　　2.2　不孕患者“种植窗”期子宫内膜CT表达

　　不孕患者“种植窗”期子宫内膜CT表达见表1。

表1　CT在正常月经周期子宫内膜中的表达（x±s）

　　与正常妇女分泌中期比较　^*P＜0.013　讨论

　　CT是含有32个氨基酸残基的肽类激素，与相应受体结合区集中在9～32位氨基酸序列，生 物活性区集中在3～6位氨基酸序列中。CT两端高度保守，对其生物活性很重要。CT主要由 甲 状腺滤泡旁C细胞合成、分泌。近几年发现，人全身各处的神经内分泌细胞都具有这种功能，只是甲状腺中的C细胞最强罢了。在其他组织如：肺、肝、小肠、垂体、下丘脑都有微量合成。最近的研究表明：子宫也可合成CT。在这些组织中合成的精确部位和功能还了解不多，但其在全身广泛分布，并存在于无脊椎动物，说明CT具有广泛的生理功能。CT的主要生理功能是通过抑制骨盐吸收和促进肾脏对钙的排泄，降低血浆Ca²⁺的水平。Lin hY 等 ^［2］ 已克隆出人类编码对CT有高度亲和力的膜受体基因。CT和其受体结合后，促进CT受体与异三聚体G蛋白的结合，活化腺苷酸环化酶和磷脂酶Cβ,参与多种细胞功能如：分化、增殖、变形。

　　3.1　CT特异性表达于种植窗期子宫内膜

　　Ding YQ 等研究发现：小鼠子宫内膜CT的mRNA和蛋白在交配后2 d开始增加，着床前1 d即交 配后第4 d达到顶峰，第5 d即着床日，CT表达开始下降，第6 d降到检测水平以下。在人类 ，着床发生在分泌中期（20～24 d），即“种植窗”期。本研究结果显示，CT在增殖期子宫内膜中无表达，分泌早期开始增加，分泌中期达到最高，晚期消失。CT特异性表达于分泌中期子宫内膜腺上皮细胞浆内，与子宫内膜“种植窗”的开放相吻合,提示：CT可能在子宫内膜容受性形成中起重要作用。CT的主要功能是调节靶细胞的Ca²⁺水平，其参与着床的可能机制 ：1，内膜腺上皮分泌CT，通过旁分泌方式作用于着床部位宫腔上皮细胞，促进细胞外Ca2+内流，降低子宫腔Ca²⁺水平，促使上皮细胞之间紧密连接松弛，有利于着床。研究发现^［3］，向体外培养的人类极性上皮细胞中加入Ca²⁺可促进细胞间紧密连接形 成，若去除Ca²⁺，则使连接松解。Ca²⁺还可促进重要的粘附分子和连接复合体再分布和表达，这些因子使极性上皮细胞转化为非极性状态，有利于内膜腔上皮细胞和滋养细胞的紧密接触；2，在妊娠早期，CT有助于维持子宫静息状态。研究发现：平滑肌细胞肌浆网内储存Ca²⁺，血管紧张素、催产素等可促进Ca²⁺释放，提高肌浆Ca²⁺浓度，使肌细胞收缩。子宫局部 释放CT可以抑制小鼠子宫和输卵管自发性和诱发性收缩^［4］，防止着床期间子宫收 缩，有 利于胚胎着床。最近研究发现^［5］：小鼠4～8细胞阶段胚胎表面存在CT受体，CT参与种植前 胚胎分化。在体外向培养基中加入CT，小鼠囊胚分化加快。这些结果提示：子宫内膜与胚胎同步表达CT，CT一方面参与子宫内膜容受性形成，另一方面促进胚胎发育，以多种机制参与着床。

　　3.2　CT与不孕的关系

　　本研究发现，存在一些不孕患者内膜组织正常，而功能异常，与正常妇女相比，子宫内膜异位症、不明原因不孕患者“种植窗”期子宫内膜中CT表达明显减少，也许，这正是其不孕的原因之一。输卵管阻塞性不孕患者CT表达比正常妇女下降，但无显著性意义。其CT表达较少原因还不清楚。这些患者中，胚泡到达子宫腔后，由于内膜“种植窗”期的开放延迟或功能缺陷而致“种植窗”缺乏，胚泡无法着床以致流产。目前尚无一个公认的评价子宫内膜功能的良好指标，CT 特异性表达于“种植窗”期子宫内膜及在不孕症患者中的异常表达，使其可作为评价子宫内膜功能的良好指标。Li ji-zhu等^［6］应用RIA技术发现，小 鼠内膜腺上皮合成CT后可能分泌到宫腔，其检测方便是其他子宫内膜标志所无法比拟的。Su shma K等^［7］的动物试验表明，孕激素通过其受体促进子宫内膜CT表达，雌激素则抑制CT 表达，但在分泌晚期和孕期高水平孕激素却不能诱导CT表达，说明由其他未知因子参与其表达调节，但其调节机制和具体作用机理还不清楚，有待于进一步探讨。

　　付志红,女,1971年生,医学硕士付志红（第一军医大学南方医院妇产科，广州　510515)

　　陈士岭（第一军医大学南方医院妇产科，广州　510515)

　　邢福祺（第一军医大学南方医院妇产科，广州　510515）

　　参考文献

　　1，Ying-Qing Ding ,Li-Ji zhu,Milan K et al. Progesterone stimulat es calcitonin g ene expression in the uterus during implantation.Endocrinology,1994,135:2265

　　2，Lin H Y, harris T L, Flannery M S et al. Expression cloning of a n adenylate cyclase-coupled calcitonin receptor.Science,1991,254:1022

　　3，Yoshinaga K. Future propect of research on endocrinology of embryo -endometrial interactions. In: Glasser S R, Mulholl J eds. Embryo-endometri al interactions. new York:Plenum Press,1994.151

　　4，Naghashpour M, Rosenblatt M I, Dickerson I M et al.Inhibitory effect of calc itonin gene-ralated peptide on myometrial contractility is diminished at partur tion. Endocrinology,1997,138:4207

　　5，Wang J, Rout U K, Bagchi I C et al. Expression of calcitonin re ceptors in mou se preimplantation embryo and their function in the regulation of blastocyst dif ferentiation by calcitonin. Development,1998,125:4293

　　6，Zhu L J, Milan K, Bagchi K et al. Attenuation of calcitonin gene expressio n in pregnant rat uterus leads to a block in embryonic implantation. Endocrinolo gy,1998,139:330

　　7，Sushma K, Zhu Li, Mary P et al. Progesterone induces calcit onin gene expression in endometrium within the putative window of implantation.J Clinic endocrinology and meta，1998,83：4443