耳聋基因与相关蛋白

听力学及言语疾病杂志 2000年第1期第8卷

作者：吴子明　王锦玲

单位：吴子明（第四军医大学西京医院耳鼻咽喉科　西安 710032）；王锦玲（第四军医大学西京医院耳鼻咽喉科　西安 710032）

　　【中图分类号】　R764.43　　　【文献标识码】　A

　　【文章编号】　1006-7299(2000)01-0047-02

　　现已发现有很多导致耳聋的基因，新近发现的基因及相关蛋白为研究基因致聋的机理及听觉信号转导通路提供了一个重要的切入点。

　　1　TECTA(α-tectorin,α-盖膜蛋白)基因

　　首先发现了一种TECTA基因，它位于11号染色体上，其编码α-盖膜蛋白(α-tectorin)，为盖膜的组成成分，作为细胞外基质悬于毛细胞之上。每个毛细胞伸出约100条静纤毛，其中最高的纤毛与盖膜相触。声音刺激时，盖膜与毛细胞间的剪切力引起静纤毛弯曲，继而牵拉临近静纤毛精细的顶端连系(tiplinks)，转而直接打开于顶端连接处的转导通道，引发反应。正常的听觉要求这种活动得到精确的维护。α-盖膜蛋白的发现提示：盖膜对于向毛细胞传递合适的刺激非常关键，为筛选耳聋基因相关的分子开辟了新途径^［1］。

　　2　非常规(unconventional)肌球蛋白及编码基因

　　肌球蛋白是机械酶，其与F-肌动蛋白结合并水解ATP产生动力。该蛋白为机械化学蛋白的一个科，参与诸如：囊泡移动、细胞突起延伸、细胞分裂、吞噬、信号转导、细胞运动、肌肉收缩等多种功能。肌球蛋白的共性是：①一个保守和原动力区(motor domain),其负责激活肌动蛋白的ATP酶；②调节区：连接一些轻链，如钙调蛋白及多种不同的尾端结构，这些结构可能参与胞膜连接或/和物质转运^［2］。根据肌球蛋白的运动区和调节区的不同可分成(到目前为止)15类(纲)，其中常规的肌球蛋白为Ⅱ类，余下为非常规肌球蛋白，现已发现三种耳聋基因编码非常规肌球蛋白，其中一种肌球蛋白的亚型与毛细胞的适应有关，现分述如下：

　　2.1　sh-1小鼠/Usher综合征IB型与肌球蛋白Ⅶα-基因　　sh-1小鼠的纯合子表现为活动过度，及与前庭功能失调的有关摇头及绕圈行为；并伴典型的神经上皮类型耳蜗缺陷，表现为Corti器功能失调及进行性退变。首先发现直接影响感觉性毛细胞的基因也编码肌球蛋白Ⅶ_α。该基因为sh-1基因，定位于小鼠的7号染色体的一个区域，其与人类染色体11q13同源，亦即Usher IB的基因定位。其存在三种变异，变异位点都位于头区，有可能引起功能蛋白缺失。sh-1鼠的α型肌球蛋白参与听觉的转导，据认为是作为细胞适应的原动力(adaptation motor)。该蛋白负责调节静纤毛间顶端连系张力，通过张力改变控制毛细胞机械转导的门控机制。有证据表明Ⅰ型肌球蛋白也与此有关，但与Ⅶα-肌球蛋白相比缺乏直接的证据。故Ⅶα可作为适应性原动力候选者^［3，4］。

　　肌球蛋白Ⅶ是第一个发现变异产物参与听觉转导的分子。为了更好地了解肌球蛋白Ⅶ的功能及其缺陷如何引起疾病的表现型，有作者制备了抗肌球蛋白Ⅶ尾区的特异性抗体，结果发现肌球蛋白Ⅶα-在耳蜗、角膜、睾丸、肺及肾脏有表达：在耳蜗，肌球蛋白Ⅶα-局限于内、外毛细胞尖端静纤毛和胞质。作者已克隆出大部分人类肌球蛋白重链cDNA和特异性作用于尾区的抗体。Usher IB相关的耳聋表现型是由于缺乏功能性肌球蛋白Ⅶα-多肽所致。肌球蛋白Ⅶα-重链在Corti器发生和功能维系起一定的作用。尽管在Usher综合征中可表现有：①异常的精子；②支气管功能缺陷。这些可归因于肌球蛋白Ⅶα-在这些组织中表达之故，但却未见有肾脏疾病的报导。这可能是因为在肾脏，尤其是远端肾小管上皮细胞有几种肌球蛋白表达，如Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、等，且这些肌球蛋白在肾脏功能有交叉，掩盖了肌球蛋白Ⅶa-功能缺乏的影响^［5］。

　　2.2　肌球蛋白Ⅰ

　　2.2.1　肌球蛋白Ⅰ的组成及分布　肌球蛋白Ⅰ由分子量为110～140 kDa的单一重链和与其相连的若干轻链组成，有三个亚型：Ⅰα表达于神经元及大脑(大鼠)、Ⅰβ表达于耳蜗和Ⅰγ表达于大脑，重链有头、颈及尾区组成。脊椎动物肌球蛋白Ⅰ同功酶(Ⅰα、Ⅰβ和Ⅰγ)是钙调蛋白分子。其重链的尾区为羧基，带正电，该部能与细胞膜相连^［6］。为了研究肌球蛋白Ⅰ酶的分布，制备了抗牛肾上腺肌球蛋白Ⅰ抗体(mAbs)。有8种抗体，M1～M3与尾端反应；M4～M8与头区反应。通过免疫斑点分析，在哺乳动物的组织中有广泛分布。且肌球蛋白Ⅰ都聚集在细胞周边，与运动有关的区域。肌球蛋白已有几种同功酶形式，其研究方法有多肽定位、免疫化学、生物分离及mRNA分析。而肌球蛋白ⅠDNA则明确有多种异构形式存在，但仍不能全面了解其异构形式及其生物学功能^［7，8］。

　　2.2.2　肌球蛋白Ⅰ的功能

　　2.2.2.1　肌球蛋白Ⅰ的酶活性　大多数肌球蛋白Ⅰ在两种条件下其有最高的酶的活性：①在生理浓度的Mg^＋＋及盐类存在的情况下，肌动蛋白丝激活ATP酶；②在EDTA(乙二胺四乙酸)存在的情况下，肌球蛋白ⅠATP酶活性被K^＋或NH^＋₄激活，但不能被Na^＋激活，这些独特的现象其生理意义还不清楚，但可用来作为肌球蛋白Ⅰ纯化的标志。此外，K^＋-EDTA ATP酶也可作为肌球蛋白Ⅰ功能一个有用的指标。

　　2.2.2.2　肌球蛋白Ⅰ与细胞膜　采用多种抗体发现肌球蛋白Ⅰ异构形式与细胞膜相连，并存在于质膜的不分化区域，肌球蛋白Ⅰ可能直接与细胞膜相连。到目前为止，所有研究过的肌球蛋白Ⅰ都有一具有与脂类连接特性的一重链延伸C-未端，使其与磷脂有较高的亲和力，可能使得肌球蛋白Ⅰ与质膜相连。并提示肌球蛋白Ⅰ对于PIP2的亲和力，可能在某种程度上把膜相关肌球蛋白Ⅰ与磷脂酶-C信号转导系统联系起来^［8］。

　　2.2.2.3　肌球蛋白Ⅰ与毛细胞适应　毛细胞为内耳感觉的接受器。纤毛束是一种机械感受性细胞器，它含20～300根静纤毛。声音及加速度等通过机械作用使纤毛束移位，使机械电转导通道开放。这些离子通道的分子门控(molecular　gates)可能与顶端连系(连接临近静纤毛的细丝)相连。据认为，在适应的过程中，肌球蛋白-Ⅰ起到维持刺激的作用。纤毛束保持在一定的位置，细胞的电反应即由峰值下降到平台。这种适应是纤毛束反应位点对于移位后的调整。这种调节涉及纤毛束内的机械性改变，因而认为适应是每个顶端连系伸入静纤毛部分运动所致^［6］。在用牛蛙球囊毛细胞进行适应性方面的研究时，有作者以能打断肌球蛋白Ⅰ的ATP酶环的化合物对毛细胞行内透析，可以阻断适应，免疫荧光显微术可发现肌球蛋白Ⅰβ集中在静纤毛尖端，即机械电转导部位，也是适应发生的部位，该作者认为肌球蛋白 Ⅰβ可能介导牛蛙内耳毛细胞的适应^［6］。

　　2.3　肌球蛋白XV(myosin XV)及其编码基因(MYO15)

　　2.3.1　MYO15　MYO15是另外一种并发耳聋并编码肌球蛋白的基因。其动物模型为shakar-2(sh-2)小鼠，其与人类DFNB3同源。sh-2为一种X辐射后小鼠发生11号染色体突变的后代，表现为隐性遗传、表现型无Preyer反射、无脑干电反应、并伴有与sh-1相似的前庭缺陷：摇头和绕圈行为。由细菌人工染色体(BAC)转基因，可矫治sh-2的前庭缺陷、耳聋及内耳的形态异常(短纤毛恢复正常)，通过BAC的序列分析，得到了MYO15。作者发现sh-2有一高度保守的部分，即运动区出现一种氨基酸替换。MYO15为耳蜗毛细胞肌动蛋白的构建所必需。1月龄sh-2小鼠内外毛细胞的静纤毛束形态异常，静纤毛很短，但SEM显示其排列几乎近于正常模式。以鬼笔环肽对Corti器染色显示一长的含肌动蛋白的结构与变异的内毛细胞相连。观察肌动蛋白染色发现：这一突起肌动蛋白束起始于表皮板之下，向基底方向延伸，在每个细胞的基底内侧可延伸达50 μm。内毛细胞这种异常结构的存在提示sh-2基因对于正常的细胞骨架形态和肌蛋白构建起关键性的作用^［9］。

　　DFNB3为一种隐性非综合征SNHL的位点，定位于人类17P 11.2通过功能及位置克隆方法，已鉴定出人类MYO15，36 kbp。在受累的三个无关DFNB3家系中序列分析发现二种误义变异、一种无义变异。

　　2.3.2　MyosinⅦ的分布　除内耳外，MYO15在其他一些组织中表达，卵巢、睾丸、肾脏、垂体、人胚胎及成人脑，然而却不表现其他类型的异常。对于MYO15基因变异不表现多效性可能归因于其他组织中非常规球蛋白表达在功能上存在交叉。相反，该变异只有在听觉系统中才有功能上的意义^［10］。

　　2.4　肌球蛋白Ⅵ及其编码基因MYO6

　　肌球蛋白Ⅵ具有非常规肌球蛋白的一般特性，MYO6变异是Snell's　waltzer小鼠耳聋的原因。最早期的内耳畸形也涉及肌动蛋白丰富的静纤毛，组织病理学显示：该种小鼠静纤毛融合在一起。在猪和小鼠中MYO6广泛表达于多种组织，MyosinⅥ与肌动蛋白相连，亦有一钙调蛋白轻链。据认为，MyosinⅥ可能与膜运动有关，也与肾脏近端肾小管肌动蛋白细胞骨架有关^［11］。

　　3　肌球蛋白基因的交叉表达

　　William等研究了人类上皮细胞系Caco-2BBe、猪上皮细胞系LLC-PK1(CL-4)人类外周血白细 胞及肝细胞的肌球蛋白多样性。通过PCR扩增得到8～11种已知的肌球蛋白，它们分属六大类。免疫斑点分析表明在Caco-2BBe细胞系中至少存在六种肌球蛋白免疫原。在不同的细胞类型中，都有肌球蛋白的交叉表达。因而推测：①在一类细胞中，各种肌球蛋白功能可能有交叉；②一些肌球蛋白对机械化学电位可能有更精细的作用，如膜通道和酶的调节^［12］。

　　4　参考文献

　　1，Karen PS,Steve DMB.More deafness Gene［J］.Science,1998,280:1403.

　　2，Mermail V,Post PL,Mooseker MS,et al.Unconventional myosins in cell movement,membrane traffic and signal transduction［J］. Science,1998,279:527.

　　3，Weil D,Blanchard J,Kaplan J,et al.Defective myosin VIIA gene responsible for Usher syndrome type I_B［J］.Nature,1995,374:60.

　　4，Gibson F,Walsh J,Mburu P,et al.A type VII myosin encoded by the mouse deafness gene shaker-1［J］.Nature,1995,374:62.

　　5，Hasson T,Heintzelman MB.Samtos-Sacchi J.Expression in cochlea and retina of myosin VIIa,the gene product defective in Usher syndrome type I_B［J］.Proc Nat1 Acad Sci USA,1995,92:9815.

　　6，MetcaIf AB,Chelliah Y,Hudspeth AJ,et al.Molecular cloning of a myosin I beta isozyme that may mediate adaptation by hair cells of the bullfrog's internal ear［J］.Proc Nat1 Acad Sci USA,1994,91:11821.

　　7，Wagner MC,Baryllco B,Albanesi JP,et al.Tissue distribution and subcellular localization or mammalian myosin I［J］.J Cell Biology,1992,119:163.

　　8，Thomas DP,Stephen KD,Henry GZ.Myosin-I［J］.Ann Rev Physiol,1991,53:653.

　　9，Frank JP,Robert AF,Yehoash R,et al.Correction or deafness in shaker-2 mice by an unconventional myosin in a BAC transgene［J］.Science,1998,280:1444.

　　10，Aihui W,Yong L,Robert AF,et al.Association of unconventional myosin15 mutations with human nonsyndromic deafness DFNB3［J］.Science,1998,280:1447.

　　11，Hsaaon T,Mooseker MS.Porcine myosin VI:characterization of a new mammalian unconventional myosin［J］.J cell Biology,1994,127:425.

　　12，Bement WM,Hasson T,Wirth JA,et al.Identification and overlapping expression of multiple unconventional myosin genes in vertebrate cell types［J］.Proc Nat1 Acad Sci USA,1994,91:6549.