人肝癌细胞系HCC-9724的建立及其生物学特性

　　第四军医大学学报2000年第21卷第6期

师长宏　施阳　施新猷　朱德生　李六金

　　摘　要:目的　建立一株肝癌细胞系HCC-9724，为肝癌研究提供实验模型.方法　无菌切除肝癌手术标本，6只裸鼠右后肢皮下包埋，体内连续传3代后，取移植瘤体外培养，绘制细胞生长曲线，光镜、电镜观察细胞形态，并进行细胞周期和染色体核形分析，用免疫荧光法测定荷瘤鼠中AFP的表达.结果　移植模型原代获得率为33.3%，潜伏期为52 d，自第3代后肿瘤获得率为100.0%，潜伏期为16 d，该模型移植瘤具有生长稳定，移植成功率高（100%），潜伏期短(10 d)，无自发消退等特点，裸鼠移植瘤标本体外培养得到肝癌细胞系HCC-9724(简称H)，其形态结构，排列方式和移植瘤的分化程度与原发瘤保持一致，且遗传学特性包括染色体形态仍为人类核型，众数维持在62～66之间，占75.0%，细胞周期分析G₁期53.5%，G₂期19.5%，S₁期27.0%，细胞群体倍增时间为23 d，建立的裸小鼠人肝癌模型具有典型的肝细胞癌特征，持续分泌甲胎蛋白（AFP）.结论　通过裸鼠体内移植瘤建立的肝癌细胞系HCC-9724，与原发癌保持相同的生物学特性，体外连续传代6 mo以上，细胞形态不变，生长周期恒定，可望作为一个稳定的细胞系.

　　关键词：细胞培养；裸鼠；细胞系；肝细胞癌

　　0　引言

　　裸鼠是在人体外进行肝癌整体研究的理想实验工具，自1960年陈瑞铭应用组织培养技术，首次成功地建立了第一例人肝癌细胞系以来，迄今国内外已建立了23株人体肝癌细胞系^［1］，均采用组织块直接培养法,为肝癌的防治研究提供了理想的实验模型，但此种建株方法，对标本要求严格，带有很大的偶然性,由于肿瘤的异质性和复杂性^［2］，随着体外传代次数的增多，瘤细胞的特性会发生较大的改变,需不断建立肝癌细胞系,对其做进一步的深入研究.

　　1　材料和方法

　　1.1　实验动物　BALB/c-nu/nu裸鼠，由北京生物药品鉴定所提供，鼠龄为4～5 wk，雌雄兼用，其实验和饲养均在SPF条件下的超净层流架中进行，灭菌处理的水和饲料供动物自由摄入.

　　1.2　主要试剂　培养基：RPMI-1640 (Gibco)，胎牛血清(FBS)(浙江金华生物制剂厂生产)，胰酶(Sigma公司)，HEPES(Gibco)，AFP-RIA(上海生物制品研究所)，羊抗兔γ-球蛋白抗体（异硫氰酸荧光素标记）(华美公司).

　　1.3　癌组织材料　HCC-9724肝癌组织是取自1997-09-22西京医院普一科手术切除的标本，男,58岁，患者右上腹部痛2 mo. B超显示右肝6.9 cm×5.8 cm×3.7 cm瘤块,AFP＞400 μg*L^-1, 病理诊断为肝细胞癌三级.肝癌组织标本离体后进行培养，在无菌条件下去除包膜，清除标本周围的纤维组织及坏死部分，用含双抗的1640 反复冲洗后，取新鲜的癌组织用弯剪刀剪成约1 mm³组织碎块.

　　1.4　细胞培养　取2～3块1 mm³新鲜的肝癌标本，包埋于裸鼠右后肢皮下，手术缝合，置SPF 条件中饲养观察，裸鼠皮下连续传代3次后,形成的组织块进行培养，得到大量上皮样肿瘤细胞，用0.2 g*L^-1EDTA-1.25 g*L^-1胰酶消化，体外传代，细胞长至F₆代时进行冻存，并进行指标检测，记做HCC-9724.

　　1.5 细胞形态特征^［3］ 　癌组织石蜡包埋切片HE染色，培养细胞用倒置显微镜观察，收集对数生长期细胞，0.01 mol的PBS洗两次，2000 r*min^-1离心10　min收集细胞，弃上清以40 mL*L^-1　pH7.4的戊二醛固定后，按电镜标本常规制备法，进行固定，包埋，超薄切片，铅-铀染色，JEM-2000型透射电镜观察.

　　1.6　细胞生长特征　按文献［3］方法进行. 调整HCC-9724细胞浓度,按1×10⁴接种于24 孔板， 置37℃50 mL*L^-1 CO₂孵箱培养,每个样品重复3孔,计数连续8 d，以培养时间为横坐标，细胞数的对数为纵坐标，绘制细胞的生长曲线. 取对数生长的HCC-9724细胞，用1.25 g*L^-1胰酶-0.2 g*L^-1EDTA溶液联合消化细胞，收集单细胞悬液， 1000 r*min^-1离心5 min弃上清，重悬浮于5 mL 4℃预冷的PBS中,缓慢加入4℃预冷的950 mL*L^-1乙醇15 mL，使终浓度为75 mL*L^-1,冰浴30 min流式细胞仪检测.

　　1.7　染色体分析　取培养48 h的HCC-9724细胞(100 mL培养瓶)加入秋水仙素工作液(秋水仙素1 mL 1 g*L^-1＋H₂ 0.9 mL) 3滴(用5号针头滴加)，至终浓度为0.02 g*L^-1,继续培养4 h，收集细胞， 1000 r*min^-1离心10 min，低渗固定，空气干燥制片后Giemsa染色，镜检50个中期的分裂相进行染色体分析.

　　1.8　肿瘤生长曲线测定　移植完成后，逐日观察移植部位有无感染，肿瘤生长后有无自然消退，每周测量肿瘤长径a和短径b，按公式W(瘤重)=(a×b²)/2计算肿瘤重量，绘制肿瘤生长曲线.

　　1.9　肿瘤标志物测定　按文献［4］法进行，对荷瘤裸鼠行眼静脉丛采血，同时收集培养细胞上清液，采用放射免疫( RIA)法测定其中AFP浓度. 处于对数生长期的细胞，消化后，用PBS洗涤1000 r*min^-1共5 min,重复两次，滴片，室温晾干后，冷丙酮固定3次，每次15 min，用抗人AFP抗血清及异硫氰酸荧光素标记的羊抗兔γ-球蛋白抗体温育处理1 h，PBS洗涤，Evans蓝染色，在荧光显微镜下观察.

　　2　结果

　　2.1　癌组织原代培养及传代　包埋组织块的裸鼠首先出现局部红肿，25 d 时包块逐渐被吸收，长至52 d后，发现一只裸鼠右后肢皮下长出约0.4 cm×0.8 cm 结节状肿瘤(Fig 1). 手术取出其部分瘤体标本剪碎包膜修成1 mm³的碎块. 按上述方法移植传代3次后，再行组织块培养. 5 d时组织块周围，开始有上皮样细胞向外生长,且长势较快,有的部位呈克隆性生长,很快聚集成团;17 d后在25 mL培养瓶中长满上皮样细胞 (Fig 2,3)，用0.2 g*L^-1EDTA-1.25 g*L^-1胰酶消化，反复贴壁，很容易就去除成纤维细胞，每周传代1～2次，开始1∶2 稀释传代，后来以1∶4稀释传代，血清量始终为150 mL*L^-1，细胞生长良好.

　　2.2　细胞形态特征　光镜观察：体外培养的细胞为多角形，核仁大可见分裂相，在相差显微镜下（Fig 3），细胞形态呈上皮样排列，生长的单层细胞有重叠生长能力，细胞呈圆形或椭圆形，核大，胞质深染，且相对较少,核仁1～2 个，细胞异型性明显，核丝分裂偶见,细胞呈弥漫分布，组织像属恶性肿瘤. 电镜观察（Fig 4）：体外培养的F₆ HCC-9724细胞，细胞核大而有异形性，核仁明显，染色质分散，稍聚于核膜，胞质较少，含有较多的线粒体，溶酶体、线粒体肿大并增多，少量的粗面内质网，胞质内有丰富的游离核糖体，细胞间排列紧密，显示出肝细胞肝癌的形态学特征.

　　2.3　细胞生长曲线　如Fig 5所示.

图 5　人肝癌细胞系HCC-9724细胞生长曲线

　　Fig 5　Growth curve of HCC-9724 cell

　　2.4　细胞生长周期　流式细胞仪测得的细胞生长状况G₁=53.5, G₂=19.5,G₂/G₁=1.873, 为亚三倍体细胞，细胞周期符合肿瘤细胞特点.

　　2.5　染色体分析 　移植瘤连续传代后，染色体仍保持人类肿瘤染色体的特点(Fig 6)， 细胞染色体众数(M)集中在62～66之间，占75.0%，存在多数中央及亚中央着丝粒染色体，而裸鼠的染色体数2n=40，且均为顶端着丝，据此可与人类染色体相区别. 在传代过程中染色体众数变化较大，提示肿瘤细胞可能向更加恶性型发展.

　　2.6　移植瘤传代特性　移植瘤皮下连续传代后，潜伏期由原代的52 d逐渐缩短并稳定在15 d左右，肿瘤的外观为圆形实体瘤，随着肿瘤体积增大被覆肿瘤的皮肤血管扩张，移植瘤生长后无自然消退，移植瘤与患者肝癌细胞相比，细胞形态基本一致，但移植瘤细胞变小，间质成分明显减少（Fig 7,8）. 自第2代后移植瘤传代成功率均为100.0%，F₆代肿瘤细胞按10⁶(0.2 mL) 接种裸鼠右后肢皮下，10 d后即可成瘤如Tab 1所示.

图 1　原代移植荷瘤小鼠

　　Fig 1　Visible tumor manifested in nude mice after SC inoculation　×200

图 2　培养5 d，组织块周围有上皮样细胞游出

　　Fig 2　Epithelioid cell grow around tissue after culturing 5 days　×200

图 3　HCC-9724细胞的正常形态

　　Fig 3　Morphology of HCC-9724 cell　×100

图 4　HCC-9724 的超微结构

　　Fig 4　Ultrastructure of HCC-9724 cell　× 4000

图 6　HCC-9724染色体分析

　　Fig 6　The chromosomes morphology of HCC-9724 cell

图 7　患者肝癌组织细胞形态

　　Fig 7　Morphology of patient’s hepatic carcinoma tissue　HE　×200

图 8　HCC-9724原位移植时裸鼠肝细胞形态

　　Fig 8　Morphology of HCC-9724 cell growing orthotopic transplantation in nude mice　HE　×200

图 9　HCC-9724 AFP免疫荧光,胞质内有较强的亮绿色荧光

　　Fig 9　AFP immunofluorescence of HCC-9724 cell bright yellow fluorescence in plasma

　　2.7　肿瘤标志物测定　放免测定表明荷瘤鼠仍保持分泌AFP,3只裸鼠外周血血清中AFP值均大于2.5 mg*mL^-1,最高达3.1 mg*mL^-1,培养细胞上清中AFP均大于18 ng*mL^-1.荧光显微镜下多数肿瘤细胞胞质内有较强的AFP亮绿色荧光(Fig 9),而对照组为阴性.

　　2.8　肿瘤生长曲线　如Fig 10所示.

表 1　肿瘤移植和传代结果

　　Tab 1　Result of heterotransplantation and passage(n=6)

图 10　皮下肿瘤生长曲线

　　Fig 10　Growth curve of carcinoma

　　3　讨论

　　目前建立人体肿瘤细胞系较常用的方法是病人组织块直接培养^［5］，由于受手术切除标本大小的限制，肿瘤细胞和正常组织交替存在，很难获到大量的瘤细胞，同时人体单细胞体外生长需要严格的培养条件，否则很难存活. 采用患者肿瘤标本接种裸鼠，瘤细胞聚积成团，优势细胞大量繁殖，通过裸鼠筛选，组织标本获得充分营养，迅速生长，传代3次后，肿瘤细胞较快的适应了裸鼠内环境，生长力旺盛，再行体外培养很容易在短期内得到稳定传代的细胞系，随移植瘤传代次数增高，细胞生长愈趋活跃.

　　本实验建立的移植瘤模型原代成功率为33.3％，潜伏期为52 d，自第3代后， 肿瘤获得率为100.0％，潜伏期为10～15 d，该模型移植瘤具有生长稳定，移植成功率高，潜伏期短，无自发消退等特点. 培养的HCC-9724肿瘤细胞失去了接触抑制现象，呈恶性生长，具有重叠生长的特点，贴壁生长部分呈扁平状，以多边形为主，非贴壁生长部分呈球形. 电镜观察具有明显异型性，符合上皮细胞癌的特点. 肝癌模型不仅在组织结构，细胞形态和移植瘤的分化程度方面与原始瘤相一致，且遗传特性包括染色形态仍为人类核形，呈亚三倍体结构，众数维持在62～66. 建立的裸小鼠人肝癌模型，具有典型的肝癌细胞特征，如持续分泌AFP. 移植瘤基本保持了原发癌的形态特点和免疫学特性, 但在不断传代过程中,移植瘤逐渐呈低分化倾向，核分裂像增多.

　　影响移植瘤生长的因素很多，如移植块的大小，新鲜程度，裸小鼠的鼠龄和性别等. 我们在实验中发现移植块的大小一般选择1 mm³较好，鼠龄4～5 wk,且移植不同性别的裸鼠, 其成活率及生长情况差异不大. 为了使移植瘤模型能准确的表达原人癌组织结构特点及由此决定的肿瘤生物学特性，本研究应注意以下两点：①对采用的移植瘤多点取材分别进行移植；②原代移植瘤生长后,对每一个瘤都继续传代,经病理检查后再决定取舍.

　　由于组织特异性,移植瘤成活率较低,黑色素瘤为86.0%,结肠癌为72.0%,肺癌为51.0%,而肝癌较不易移植成功,Hirohashi^［6］报道为29.0%,汤钊猷^［7］报道为11.1%. 人癌裸鼠异种移植成功率为28.3%,这样使得临床标本很难在裸鼠体内建立相对应的肿瘤. 由于人体二倍体细胞在培养过程中维持有限的生长期,使已建立起的肿瘤移植模型很难稳定存在，如何超过有限的生存期,使细胞获得永久性增殖能力是临床标本建立肿瘤细胞系的关键. HCC-9724肝癌细胞系已体外传至50代,细胞生长稳定,皮下接种裸鼠100.0%成瘤,可作为一个细胞系.

　　基金项目:军队“九五”医药卫生课题 (98M107)

　　作者简介:师长宏(1973-),男(汉族)，陕西省眉县人. 硕士，助理实验师. Tel.(029)3373229　Email.changhong@fmmu.edu.cn

　　师长宏（第四军医大学实验动物研究中心,陕西 西安 710033）

　　施阳（第四军医大学实验动物研究中心,陕西 西安 710033）

　　施新猷（第四军医大学实验动物研究中心,陕西 西安 710033）

　　朱德生（第四军医大学实验动物研究中心,陕西 西安 710033）

　　李六金（第四军医大学实验动物研究中心,陕西 西安 710033）

　　参考文献:

　　［1］ 董春荣，周荣华，吕发度. MMC-7721人体肝癌细胞侏的建立及其生物学特性的初步观察［J］. 第二军医大学学报,1980;1(1):5-8.

　　［2］ Young SD, Hill RP. Dynamic heterogeneity isolation of murine tumor cell populations enriched for metastatic variants and quantification of the unstable expression of the phenotype［J］. Clin Expl Metastasis,1989;7(4):153-157.

　　［3］ 司徒镇强，吴军正. 细胞培养［M］. 西安：世界图书出版公司,1996：173-196.

　　［4］ 胡川闽,刘彦仿,隋延仿et al. 人肝癌细胞系HCC-9204的建立及其特性研究［J］. 第四军医大学学报, 1995；18（3）：8-11.

　　［5］ 刘锡忠,胡敬群,崔惠云 et al. 人肝癌裸小鼠模型的建立及其生物学特性的研究［J］. 中国医学科学院学报,1995；17（2）：98-102.

　　［6］ Hirohashi S,Shimosato Y,Kameya T et al Production of alphe-fetoprotein and normal serum proteins by transplanted human hepatic carcinomas in relation to their growth and morphology［J］. Cancer Res,1995;55(39):1819-1822.

　　［7］ 汤钊猷. 裸鼠人体肝癌移植模型的研究. 模型的建立及其血清学与形态学特征［J］. 上海第一医学院学报,1989；9(1)：21-24.