Kupffer细胞在实验性肝癌形成中的作用

中华病理学杂志 1998年第2期第0卷

作者：朱海轸　阮幼冰　武忠弼　S Ivankovic

关键词：肝肿瘤，实验性；二乙基亚硝胺；钆；原癌基因蛋白质P21(RAS)；蛋白质p53；Kupffer细胞

　　【摘要】　目的　探讨Kupffer细胞对大鼠实验性肝癌形成的影响。方法　应用免疫组化和原位分子杂交技术，对单纯用化学致癌剂二乙基亚硝胺(DENA)及氯化钆(gadolinium chloride，GC)填充Kupffer细胞后，同时给以DENA所引起的大鼠肝癌形成过程中的增殖细胞核抗原(PCNA)、表皮生长因子(EGF)、ras p21、p53蛋白及c-myc基因表达进行了对比研究。结果　结果显示：PCNA、EGF表达在两组动物肝组织中未见明显差异；GC+DENA组ras p21表达阳性率明显高于DENA组；p53蛋白的表达在GC+DENA组略高于DENA组，但出现时间则远较DENA组为早，前者出现于第11周，后者则在第19周；c-myc基因表达强度GC+DENA组明显高于DENA组。结论　上述结果提示Kupffer细胞能够降低化学致癌剂对肝细胞的毒性损伤，从而在一定程度上对肝细胞的癌变过程可能具有抑制作用。

　　The influence of kupffer cells on experimental hepatocarcinogenesis　Zhu haizhen, Ruan Youbing, Wu Zhongbi, et al. Department of Ultrastructural pathology, Tongji Medical University, Wuhan 430030

　　【Abstract】　Objective　In order to explore the influence of Kupffer cells on experimental hepatocarcinogenesis.Medoths A comparative study on the expression of proliferating cell nelclear antigen (PCNA), epidermal growth factor (EGF), ras P21, p53 protein and c-myc gene by means of immunohistochemistry or in situ hybridization during the diethylnitrosamine(DENA)-induced hepatocarcinogenesis performed in rats with and without pretreatment with gadolinium chloride (GC) which might effectively block the activity of Kupffer cells.Results There was no marked difference in the expression of PCNA and EGF in the liver tissue between the above two groups animals. The positive rate of ras P21 was markedly higher in the GC+DENA group than in the DENA group. The positive rate of p53 protein in GC+DENA group was slightly higher than that of the DENA group, however, the appearance of expression was markedly earlier in the former group(in the 11th and the 19th week respectively). The expression intensity of c-myc gene was markedly higher in GC+DENA group that in DENA group.Conclusions The results suggest that Kupffer cells can reduce hepatotoxicity induced by chemical carcinogen, and Kupffer cells may play an inhibitory effect on the process of hepatocarcinogenesis.

　　【Key words】　Liver neoplasms, experimental　　Diethylnitrosamine　　Gadolinium　　Proto-oncogene protein P21(ras)　　Protein p53　　Kupffer′s cell

　　Kupffer细胞的抗肿瘤功能近年来愈来愈受到重视。许多体内、外实验研究表明：Kupffer细胞具较强的吞噬和杀伤肿瘤细胞的能力，从而阻止癌细胞的肝内转移，这一作用可通过抑制剂或激活剂而减弱或增强^［1，2］。Kupffer细胞除本身具吞噬和杀伤肿瘤细胞能力外，还可促进T细胞增殖及增强肝、脾NK细胞活性，从而调节T细胞及NK细胞对肿瘤的杀伤作用。因此，Kupffer细胞在对已形成的肿瘤细胞的杀灭及癌细胞的肝转移的阻抑等方面的作用已被人们所证实，但Kupffer细胞能否阻遏实验性肝癌的发生，目前尚不清楚。我们运用免疫组化和原位杂交技术对单纯用二乙基亚硝胺(diethylnitrosamine，DENA)及用氯化钆(gadolinium chloride，GC)阻断Kupffer细胞活性后，再以DENA诱发大鼠肝癌，并对两组动物癌变过程中的变化进行比较观察，藉以了解Kupffer细胞在实验性肝癌形成过程中的作用。

材料和方法

　　1.动物模型建立：正常雄性SD大鼠100只，随机分为四组：(1)单纯DENA组，以70 mg/kg剂量的DENA灌胃，每周一次，连续给药15周后停药。(2)GC+DENA组，以10 mg/kg剂量的氯化钆尾静脉注射，每二周一次，以填塞Kupffer细胞，隔日再给以DENA，剂量及方法同DENA组。(3)单纯GC组，以10 mg/kg剂量的氯化钆尾静脉注射，每二周一次，以填塞Kupffer细胞。(4)正常对照组，大鼠以正常标准饲料喂养及自由饮水。各组动物分别于第11、13、15、16、18、19及21周各处死4只，取肝组织，分别放入4%多聚甲醛和10%中性福马林固定液固定，常规石蜡包埋。

　　2.方法：石蜡包埋肝组织制成厚5μm连续切片，进行处理：(1)HE染色及病理组织学检查。(2)免疫组化方法及试剂：鼠抗增殖细胞核抗原(PCNA，1∶200)、鼠抗表皮生长因子(EGF，1∶40)、鼠抗p53(1∶60)均为德国Boehringer mannheim公司产品，SP法；鼠抗ras p21(1∶50，美国Sigma公司)为SABC法；SP试剂盒为德国Boehringer mannheim公司，工作滴度1∶100，SABC试剂盒购自武汉博士德公司，工作滴度1∶100，具体操作步骤按试剂盒说明。(3)原位杂交：c-myc cDNA探针购自北京军事医学科学院。应用地高辛随机引物法标记探针，方法及步骤依试剂盒操作流程进行。组织切片常规脱蜡入水，0.2 mol/L HCl室温20分钟，蛋白酶K37℃消化15分钟，0.2%甘氨酸10分钟，37℃杂交液2小时，42℃杂交36小时。杂交完毕，洗涤切片，免疫检测及酶显色反应按试剂盒说明进行。设阳性及阴性对照：用已知阳性切片作阳性对照，以切片不加探针及阳性切片经RNA酶消化后再行杂交作阴性对照。

　　应用本室购置的德国Leiz ASM 68K图像分析仪对原位杂交阳性信号表达强度进行定量测定，每张阳性切片随机选5个视野(10×20)，每个视野经滤光后随机选取20～25个阳性细胞，测定其阳性区域平均面积、平均吸光度、积分吸光度和阳性单位值。

结果

　　1.肉眼及病理组织学检查：肉眼观，除正常对照组和单纯GC组外，其余两组动物肝组织表面自诱癌第4周起均可见白色点状增生结节，随诱癌时间延长，结节逐渐增大，其大小在两组间有明显差异：单纯DENA组最大结节约0.5 cm，而GC+DENA组其最大结节可达1.2 cm。两组动物均未见有癌转移。病理组织学检查见GC+DENA组动物肝组织于诱癌第19周时业已显示出癌变形态学特征，即见有细胞形态及大小不等，胞浆嗜碱性，胞核体积增大，核大小不等的结节形成。该组4只动物中3只于21周时已形成肝细胞性肝癌，而单纯DENA组至诱癌第21周，未见1例发展为癌，仅在2例见有肝细胞胞浆嗜碱性增强和核增大，1例呈腺样增生。

　　2.免疫组化检查：正常对照组和单纯GC组肝组织在各项免疫组化反应中均呈阴性。单纯DENA组与GC+DENA组肝组织对PCNA、EGF反应阳性率无明显差异，且均在处死动物的最早时期(第11周)业已具有强阳性表达。p53阳性表达在两组间有较明显差异，GC+DENA组出现时间远较单纯DENA组为早，前者于第11周及第16周即已出现阳性表达(图1)，后者仅在第19周才呈现阳性结果。ras p21阳性(图2)表达率在DENA组与GC+DENA组亦有明显差异，前者为30%，后者却高达70%。

　　3.c-myc基因原位杂交结果：正常对照组和单纯GC组呈阴性反应。自诱癌第11周起，DENA组及GC+DENA组均可见多个结节呈阳性反应，阳性信号定位于胞核，少数亦见于胞浆(图3)。随诱癌时间延长，阳性结节逐渐增多。运用图像分析仪测定两组肝组织阳性信号区域平均面积、平均吸光度、积分吸光度和阳性单位值发现：GC+DENA组各项参数均明显高于DENA组(附表)。

附表　c-myc基因在DENA及GC+DENA组肝组织中的表达(±s)

　　U检验，GC+DENA组各项参数均明显高于DENA组(P＜0.01)

讨论

　　氯化钆是一种特异的Kupffer细胞填塞剂^［1～3］。本实验经大鼠尾静脉注入该填塞剂以阻断Kupffer细胞正常功能，并再给予DENA诱发大鼠肝癌，以观察Kupffer细胞对肝癌形成的影响。我们的实验结果显示：在诱癌过程中，GC+DENA组与DENA组间，其肝组织增生结节大小、p53蛋白阳性表达出现时间、ras p21蛋白阳性表达率以及c-myc基因表达状况均显示出明显差异，上述结果提示氯化钆填塞Kupffer细胞，导致Kupffer细胞功能损伤可加速肝细胞的癌变过程。

　　我们实验所显示的PCNA及EGF阳性表达结果在两组间未见明显差异。对此结果，我们的看法是，单纯的细胞增殖而无癌基因突变，不能说明癌变过程，只有当癌基因出现突变时，细胞的增殖才显示出癌变的危险。

　　图1　大鼠肝组织p53表达　SP法×200　图2　大鼠肝组织ras p21表达　SABC法×200　图3　大鼠肝组织c-myc基因表达　原位杂交×200　(图1～3均为 gC+DENA组，诱癌第11周)　　根据文献报道，p53蛋白的高度表达与疾病进展有关，也与组织由异型性向癌肿转化有关^［4～6］。我们实验中p53蛋白阳性表达时间在GC+DENA组明显较DENA组为早，提示GC+DENA组肝细胞由单纯增殖过渡到向癌转化的时间较DENA组为早，这一结果与我们的病理组织学检查结果一致。

　　ras p21具有诱导肝肿瘤发生作用^［7，8］，c-myc基因参与对细胞增殖和分化的调节^［9，10］。我们实验结果亦证实了ras p21及c-myc基因表达强度在GC+EDNA组明显高于DENA组，这就从分子水平揭示了Kupffer细胞功能的丧失，可导致致癌剂对肝细胞的毒性损伤，而具有正常功能的Kupffer细胞可降低化学致癌剂对肝细胞的毒性作用，从而在一定程度上对肝细胞的癌变过程可能起一定的抑制作用。

参考文献

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(收稿：1997-09-05　　修回：1998-02-06)