原发性肝癌及慢性肝脏病变端粒酶活性的研究

中华病理学杂志 1998年第2期第0卷

作者：吴珊　刘宗石　李晓明　WY Lau　CK leow　吴秉铨　李川军

单位：香港中文大学病理解剖和细胞学系［吴珊(130021 长春，白求恩医科大学病理学教研室)、刘宗石、李晓明、李川军］；外科学系(WY Lau、CK Leow)；北京医科大学病理学系(吴秉铨)

关键词：肝肿瘤；端粒；染色体；甲胎蛋白类

　　【摘要】　目的　比较原发性肝细胞癌(HCC)及其癌旁不同慢性病变组织端粒酶活性的异同，探讨端粒酶活性在恶性肿瘤诊断中的意义。方法　用TRAP方法检测38例HCC及其癌旁不同慢性病变肝组织的端粒酶活性。同时以4例正常肝组织为对照。结果　38例HCC中32例显示端粒酶活性(86.8%)。端粒酶活性与HCC的细胞分化、类型、大小及有无乙型肝炎病毒(HBV)感染无关，但与病人血清中甲胎蛋白(AFP)水平相关。端粒酶活性阴性组AFP水平明显低于各阳性组(P＜0.01)。正常肝(4例)、先天性胆管闭锁(4例)、肝小叶间纤维增生(2例)、慢性病毒性肝炎(2例)及未见明显病变肝组织(7例)均未见有端粒酶活性。25例肝硬化中4例端粒酶呈弱活性。结论　端粒酶活性见于大多数HCC及个别肝硬化组织，其活性可能在HCC的发生、发展中起重要作用，有希望成为恶性肿瘤诊断的标记物。

　　Study on telomerase activity in hepatocellular carcinoma and chronic hepatitc disease　Wu Shan, Liew CT, Li Xiaoming, et al. Department of Anatomical and cellular Patholoty, The Chinese University of Hong Kong

　　【Abstract】　Objective　To compare telomerase activity of hepatocellular carcinoma (HCC) with that of chronic liver disease to analyze the significance of telomerase activity in diagnosis of malignancy.Methods Telomerase activity was detected in 38 cases of HCC and corresponding non-tumor liver tissue with different chronic disease. That is 21 cases of hepatitc cirrhosis, 2 cases of mild fibrosis, 2 cases of chronic viral hepatitis and 7 cases of non-tumor liver with no significant histopathological changes using TRAP assay. 4 cases of biliary atresia were also detected and 4 cases of normal liver tissue were the control.Results Telomerase activity was detected in 32 of 38 (86.8%) cases of hCC. Telomerase activity in HCC was not related with tumor cell differentiation types, tumor size and HBV infection, but expression of telomerase was highly correlated with serumα-fetal protein (AFP) level of patients. Telomerase negative HCC group has statistically significant lower level of AFP (P＜0.01) when compared with telomerase positive HCC groups. Telomerase activity was not present in normal liver tissue (0/4), biliary atresia (0/4), mild fibrossis (0/2), chronic viral hepatitis (0/4) and no significant changes of non-tumor liver tissue (0/7). Weak telomerase activity was detected in 4 of 21 hepatitic cirrhosis. Conclusion Telomerase acitivity was only detected in most of HCC and few cases of hepatitc cirrhosis, which may play a crucial role in hepatocarcinogenesis and may be useful for the diagnosis of malignancy.

　　【Key words】　Liver neoplasms　　Telomere　　Chromosomes 　　alpha Fetoproteins

　　端粒为真核细胞染色体末端的多个重复序列(TTAGGG)。这一结构在染色体复制及保持染色体稳定中起重要作用^［1］ 。研究显示，人类体细胞端粒DNA长度随着每次细胞分裂逐渐缩短^［2］ 。端粒酶为一种核糖核蛋白，它能重新填补染色体末端已缩短的端粒。因此，能长期存活的细胞或恶性肿瘤细胞其端粒长度稳定不变可能是由于有活性端粒酶的存在^［3］ 。以往检测端粒酶活性的方法繁琐、组织需求量大、所得信号弱。1994年Kim等^［4］引用PCR技术大大改良以往检测方法，形成名为端粒重复扩增检测法即TRAP法之后，人们对人多种肿瘤组织端粒酶活性进行了检测^［5］ 。我们选择我国最常见的恶性肿瘤之一——原发性肝细胞癌(HCC)，对HCC及癌旁不同慢性病变肝组织和正常肝的端粒酶活性进行全面系统的检测，以探讨端粒酶活性在恶性肿瘤诊断中的意义。

材料和方法

　　1.病例及取材：84份不同肝组织样本取自我院1991年～1995年新鲜手术切除标本。手术后标本立即在液氮中冷冻，保存于-80℃低温。84份肝组织包括38例HCC及其癌旁非肿瘤肝组织，4例先天性胆管闭锁肝和4例正常肝(取自肝移植供体肝)。38例癌旁肝组织中，27例显不同程度肝硬化及肝小叶间纤维组织增生、4例慢性病毒性肝炎、7例未见明显病变。

　　2.端粒酶活性测定：用Kim等^［4］所述方法先进行提取。简述之：肝组织迅速在无钙、镁冷的PBS缓冲液中洗去血污，匀浆、离心、其沉淀再用冷的洗液(10 mmol/L Hepes-KOH pH7.5，1.5 mmol/L MgCL₂ ，10 mmol/L KCL，1 mmol/L DTT)离心清洗一次后，沉淀与冷的裂解缓冲液(10 mmol/L Tris-HCL pH7.5，1 mmol/L EDTA，1 mmol/L PMSF，5 mmol/L β-巯基乙醇，0.5% CHAPS，10%甘油)冰浴30分钟，其间偶尔振荡混匀，高速离心(15 00 g)30分钟、4℃。上清即所需的提取液。提取液经蛋白浓度测定(DC，Protein Assay试剂盒，BIO-RAD公司)后稀释1 μg蛋白/μl。用TRAP-eze^TM端粒酶测定盒(Oncor公司，美国)，TRAP方法做端粒酶活性测定。12.5 μl的反应体系中含有0.5 μl的组织提取液，先于30℃下温浴20分钟后进行PCR循环，其产物经12.5%聚丙烯酰胺凝胶电泳后，放射自显影。为测定端粒酶活性的强弱，将每个样品提取液做三个不同稀释度，即：1×(1 μg蛋白/μl)；10×(0.1 μg蛋白/μl)；100×(0.01 μg蛋白/μl)。RNA酶处理样品提取液做阴性对照，阳性对照于药盒内提供。

　　3.端粒酶活性强度判定：参阅Hiyama等^［6］半定量方法，即：强：提取液100倍稀释(0.01 μg蛋白)仍能检测到酶活性；中：提取液10倍稀释(0.1 μg蛋白)能检测到酶活性；弱：提取液在1 μg蛋白时方能检测到酶活性；阴性：任何浓度均检测不到酶活性。

结果

　　肝癌组织端粒酶活性：38例HCC中有33例显端粒酶活性(86.8%，表1，附图)。高分化6例，5例有酶活性；高～中分化6例均有酶活性；中分化10例，9例有酶活性；低分化2例，1例有酶活性；透明细胞性3例均有酶活性。由此可见端粒酶活性与肝癌细胞的分化状态没有明显的关系。直经大于5 cm的HCC端粒酶活性的阳性率似比小于3 cmHCC高，但两者无显著性差异。32例HBV阳性HCC中有28例显端粒酶活性，而6例HBV阴性的HCC有5例显端粒酶活性，表明端粒酶活性与乙型肝炎病毒(HBV)感染亦不相关。但端粒酶活性与病人血清中甲胎蛋白(AFP)水平密切相关。所有端粒酶活性病例，包括强活性、中度活性和弱活性病例其血清中AFP水平明显高于端粒酶阴性病例组(表2，P＜0.01)。端粒酶活性与病人血清白蛋白、碱性磷酸酶水平无关。

表1　原发性肝细胞癌端粒酶活性的结果

　　提取液不同稀释度：×1=1μg蛋白，×10=0.1μg蛋白，×100=0.01μg蛋白，RNase即样品经RNA酶处理后进行端粒酶测定，81、83为病人编号，T：肿瘤组织(HCC)，NT：相应癌旁组织

附图　原发性肝癌及相应癌旁组织端粒酶活性检测结果

表2　肝癌组织端粒酶活性与病人血清中

　　甲胎蛋白、白蛋白和碱性磷酸酶的关系

端粒酶活性	例数	±s
		甲胎蛋白	白蛋白		碱性磷酸酶
强	10	2 500±1 457		36±25		116± 42
中	17	5 895±5 737		36± 4		156±231
弱	6	4 776±1 400		39± 8		154±154
阴性	5	747± 510*		32± 7		134± 78

　　^* P＜0.01　　非肿瘤肝组织端粒酶活性：正常、先天性胆管闭锁、癌旁未见明显病变、肝小叶间纤维组织增生及慢性病毒性肝炎肝组织端粒酶活性均为阴性。但癌旁伴有肝硬化25例组织中，4例显示端粒酶弱活性，其中1例在该硬化组织中央静脉内见有肝癌细胞栓子，其余3例肝硬化组织显示同时伴有中到重度肝细胞不典型增生。

讨论

　　HCC是我国最常见恶性肿瘤之一，预后差。虽然在HCC内已观察到有数个基因改变，但至今未见有特异性HCC诊断基因的报道。近年研究表明，染色体末端端粒缩短及端粒酶活性已为许多恶性肿瘤所特有，因此有希望成为恶性肿瘤诊断的标记物^［5］。自1994年TRAP分析法建立以来，人们已对许多人体组织端粒酶活性进行检测，大多数报道显示除生殖细胞和造血干细胞外，人体正常组织细胞未见有端粒酶活性。端粒酶活性主要存在于大多数恶性肿瘤组织中^{［5，7，8］}。

　　本研究系统地比较了正常肝组织、慢性肝病变及HCC的端粒酶活性。38例HCC中32例端粒酶显活性(86.8%)，此结果与Tahara等^［7］和Nouso等^［8］报道相似。虽然低分化HCC端粒酶活性阳性率略低于中到高分化HCC，但两者无显著性差异。低分化HCC组织中常伴有许多坏死，这可能是导致端粒酶活性阳性率降低的原因，但需进一步澄清。端粒酶活性与HCC大小无关表明端粒酶在早期HCC中就已显活性，这将对早期HCC诊断极有帮助。HCC端粒酶活性与病人血清中AFP水平密切相关。虽然在各端粒酶活性阳性组包括强、中、弱活性组之间AFP水平未见明显差异，但端粒酶阴性组AFP水平明显低于各阳性组。端粒酶活性和病人血清AFP水平之间出现相关性的机理尚不明了，但我们看到HCC中AFP增加同时伴端粒酶活性的表达。

　　HCC的发生是个多步骤基因改变的结果，p53基因异常是在HCC的晚期出现而很少见于高分化或小HCC结节^［9］。人们普遍接受病毒性肝炎和肝硬化是HCC先兆，肝硬化再生结节若同时伴有明显的腺瘤样增生或肝硬化结节内大量肝细胞不典型增生就会使活检组织早期HCC诊断十分困难。端粒酶活性的检测可能会对更好区别早期HCC和肝硬化带来希望。

　　已报道在50种人正常体细胞和正常培养细胞均未见端粒酶活性^［4］。我们研究中正常肝组织亦无该酶活性，同时发现先天性胆管闭锁、癌旁未见明显病变、肝小叶间纤维组织增生、慢性病毒性肝炎肝组织均未见端粒酶活性。25例肝硬化4例显端粒酶弱活性(16.0%)，此阳性率明显低于以往报道，我们考虑可能与各组HCC癌周肝硬化组织中不典型增生细胞的比例不同有关。

参考文献

　　1　Blackburn EH. Structure and function of telomerase. Nature, 1991, 350：569-573.

　　2　Harley CB, Kim NW, Prowsa KR, et al. Telomerase, Cell immortality and cancer. Cold Spring Harbor Symp. Quant Biol, 1994，59：307-315.

　　3　Greider CW, Blackburn EH. Identification of a specific telomere terminal transferase activity in tetrahymena extracts. Cell, 1985, 43：405-410.

　　4　Kim NW, Piatyszek MA, Prowse KR, et al. Specific association of human of telomerase activity with immortal cells and cancer. Science, 1994, 266：2011-2015.

　　5　Jessy WS, Wooding EW. Telomerase activity in human cancer. Curr Opin Oncol, 1996, 8：66-71.

　　6　Hiyama E, Hiyama K, Yokoyman T, et al. Correlating telomerase activity levels with human neuroblastoma outcomes. Nat Med, 1995, 1：249-254.

　　7　Tahara H, Nakanish T, Kitamoto, M, et al. Telomerase activity in human liver tissues: comparison between chronic liver disease and hepatocellular carcinomas. Cancer Res, 1995, 55：2734-2736.

　　8　Nouso K, Urabe Y, Higashi T, et al. Telomerase as a tool for the differential diagnosis of human hepatocellular carcinoma. Cancer, 1996, 78：233-236.

　　9　Murakami Y, Hayashi K, Hirohashi S, et al. Aberrations of tumor suppression p53 and retinoblastoma genes in human hepatocellular carcinomas. Cancer Res, 1991, 51：5220-5225.

(收稿：1997-08-07　　修回：1998-02-11)