莪术油对小鼠肝癌增殖细胞核抗原的影响

世界华人消化杂志 1999年第2期第0卷 专家述评

作者：石灵春　吴万垠　张维彬　区勇全　谭　敏　肖楚梅

单位：石灵春　张维彬　谭　敏　肖楚梅　　州中医药大学第二附属医院　病理科； 吴万垠　　肿瘤科； 区勇全　　中心实验室　　广东省广州市　510120

关键词：肝肿瘤；莪术油；增殖细胞核抗原

	世界华人消化杂志 WORLD CHINESE JOURNAL OF DIGESTION 　　1999年 第2期 No.2 1999

　　中国图书资料分类号　R735.7

　　摘　要

　　目的　揭示莪术油对小鼠肝癌细胞增殖活性的抑制作用.

　　方法　用莪术油进行2次抑制小鼠肝癌HepA实验.以抗增殖细胞核抗原(PCNA)免疫组化染色方法，评估莪术油对小鼠肝癌细胞增殖活性的影响.

　　结果　莪术油对小鼠肝癌HepA的抑瘤率分别为52%和51%，与对照组比有显著性差异(P＜0.01).经莪术油作用过的小鼠HepA肝癌细胞的PCNA阳性指数(PCNA-PI)为30±4，显著低于对照组40±6(P＜0.01).

　　结论　莪术油抑制小鼠肝癌生长可能与其抑制PCNA表达有关.

Effect of curcuma aramatica oil on

　　hepatoma in mice

SHI Ling-Chun¹, WU Wan-Yin², ZHANG wei-Bin¹, QU Yong-Quan³, TAN Min¹ and XIAO chu-Mei¹¹Department of Pathology, ²Department of Oncology, and ³Central Laboratory, the second Affiliated Hospital of Guangzhou TCM university, Guangzhou 510120, Guangdong Province, china

　　Subject headings　liver neoplasms; curcuma aramatica oil; proliferating cell nuclear antigen

　　Abstract

　　rESULTS　The tumor inhibitory rates of CAO were 52% and 51% in two experiments, respectively. Compared with those of the saline-treated control group, the differences were statistically significant (P＜0.01). in the group of mice treated with CAO, the positive indexes of proliferating cell nuclear antigen (PCNA-PI) were 30±4, which were significantly lower than 40±6 of the control group (P＜0.01).

　　cONCLUSION　The inhibition of CAO on the growth of hepatic carcinoma in mice might be associated with its effect on PCNA expression.

　　0　引言

　　较多研究提示，从活血破瘀中药莪术中提取的莪术油对多种癌细胞有抑杀作用^［1］.我们在进行莪术油对小鼠肝癌HepA的体内抑瘤实验基础上，利用抗增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)免疫组化染色方法，研究了莪术油对肝癌细胞增殖的抑制作用.

　　1　材料和方法

　　1.1　材料　昆明种小鼠，体重18g～22g，每次实验性别相同，由第一军医大学实验动物中心提供. hepA肝癌荷瘤小鼠由中山医科大学肿瘤研究所提供.可供静脉注射的10g/L莪术油注射液由我院制剂室制备，批号97041601.氟脲嘧啶注射液(5-FU)为天津市河北制药总厂生产，批号970277，用前以生理盐水稀释至所需浓度.免疫组化LSAB kit(K0679)及PCNA单克隆抗体PC10(M0879)均购自丹麦Dako公司.福尔马林、DAB显色剂、乙醇、二甲苯等购于市售.

　　1.2　方法

　　1.2.1　小鼠体内抑瘤实验　于本院二级动物实验室中，无菌操作，取荷瘤肝癌HepA小鼠腹水，稀释至含瘤细胞2×10¹⁰/L，置冰上，每鼠右腋皮下接种0.2mL.接种次日将小鼠随机分成3组：阴性对照组，腹腔注射等体积生理盐水,ip；阳性对照组，5-FU20mg，40mg/kg,ip；治疗组，莪术油100mg/kg，ip. 实验进行2次(表1).停药次日处死小鼠，剥离肿瘤，称体重及瘤重，计算抑瘤率.

　　1.2.2　PCNA免疫组化染色　第2次实验后，留取治疗组及阴性对照组小鼠肿瘤标本用100mL/L福尔马林固定，常规脱水包埋，厚4μm连续切片. lSAB法免疫组化染色参照说明书，简述步骤如下：切片经二甲苯脱蜡后，梯度酒精水化；30mL/L h₂O₂消除内源性酶；加PC10抗体(1∶100稀释)后温浴30min；LINK：孵浴15min；加链激素抗生物素蛋白孵浴15min；DAB显色；苏木素复染.常规脱水、透明、封片. 实验另设PBS代替抗体作阴性对照及阳性对照片.显微镜下观察，细胞核呈棕黄色者为阳性.计数方法：于高倍镜下，每例随机观察几个视野(细胞总数大于2000)，计算PCNA阳性指数(PCNA-PI，%)，取平均值.

　　2　结果

　　2.1　莪术油对HepA肝癌小鼠的抑瘤作用　两次实验结果，莪术油的抑瘤率分别为52%和51%(P＜0.01，表1).抑瘤实验结束时，5-FU组动物体重呈减轻趋势，而莪术油组小鼠体重虽有增长，但同阴性对照组比有显著性差异(P＜0.05).

表1　莪术油ip对小鼠HepA肝癌生长的抑制作用　　(n=10,±s)

^bP＜0.01，vs 阴性对照组.

　　3　讨论

　　近年研究表明，莪术油含有β-榄香烯、莪术醇等多种抗癌成分^［2-5］.至今对莪术油复合成分抑癌机制的研究较少.我们用莪术油对小鼠HepA进行体内抑癌研究，抑瘤率达50%左右，同早年的一些报道结果基本一致.莪术油对小鼠体重的影响则可能由于所荷肿瘤小于阴性对照组，而其所具毒性则轻于5-FU.本文对该药物抗肝癌作用机制的研究将对进一步研制含莪术油的新抗癌剂具有指导意义.

　　增殖细胞核抗原(PCNA)为DNA多聚酶δ的辅助因子，作用于细胞的S期及与DNA修复相关的DNA合成过程中^［6，7］. hino et al^［8，9］研究发现，PCNA的表达与肝细胞癌(HCC)的组织恶性度密切相关. irene et al^［10］和Suehiro et al^［11］通过免疫组化分析则发现，PCNA标记指数与肝细胞癌的转移特征及预后显著相关.因此，PCNA可作为评估HCC增殖活性的一个重要指标. 我们用LSAB免疫组化法对小鼠HCC细胞核进行染色，检测出的PCNA阳性细胞为G₁晚期及S早期细胞.各组免疫组化实验结果表明，莪术油能显著降低对照组小鼠HepA肝癌PCNA阳性细胞数(P＜0.01).据此推测，莪术油对小鼠HCC生长的抑制作用可能是通过抑制PCNA蛋白的表达，从而降低DNA多聚酶δ的活性，干扰肿瘤细胞DNA的合成，阻断细胞进入S期而停止增殖.这种作用可能系莪术油中所含多种抗癌成分复合作用的结果.有关莪术油对小鼠HCC细胞异常增殖活性的作用机制有待进一步研究.

　　作者简介：石灵春，男，1952-05-25生，辽宁省辽阳市人，汉族.1975年广州医学院医疗系毕业，主治医师.

　　通讯作者　吴万垠，510120，广州中医药大学第二附属医院肿瘤科，广州市大德路111号.

　　Correspondence to:WU Wan-Yin, Department of Oncology, the second Affiliated Hospital of Guangzhou TCM University, 111 Dadelu, Guangzhou510120, Guangdong Province, China

　　tel. +86·20·81887233 Ext. 368

　　4　参考文献

　　［1］　时继慧，李成章，刘德兰.温莪术挥发油的实验药理研究. 中药通报，1981；6：36-38

　　［2］　左云飞，张辉铮，魏巍，张胜亮，张红，张立秋.榄香烯对肝癌腹水瘤细胞系Hca-F25/CL-16A3的抗肿瘤作用机理研究：Ⅰ对小鼠NK细胞毒性、巨嗜细胞活性及脾细胞增殖的影响.中药药理与临床，1996；12：7-9

　　［3］　张红，张立秋，左云飞，张辉铮，魏巍，张胜亮.榄香烯对肝癌腹水瘤细胞系Hca-F25/CL-16A3的抗肿瘤作用机理研究：Ⅱ对小鼠脾细胞产生白细胞介素-2的影响.中药药理与临床，1996；12：9-11

　　［4］　王宝成，郭军，狄剑时，师秋丽.榄香烯乳剂与肿瘤多药耐药的基础研究. 中国肿瘤临床，1996；23：143-146

　　［5］　袁文学. 莪术醇磷酸酯单钠抗肿瘤实验研究.沈阳药学院学报，1984；12：210-213

　　［6］　Lee SH, Hunwitz J. Mechanism of elongation of primed DNA by DNA polymerase delta, proliferating cell nuclear antigen, and activator 1. Proc Natl acad Sci USA, 1990;87:5672-5676

　　［7］ Shivji KK, Kenny MK, Wood RD. Proliferating cell nuclear antigen is required for DNA excision repair. Cell, 1992; 69:367-374

　　［8］ Hino N, Higashi T, Nouso K, Nakatsukasa H, Tsuji T. Apoptosis and proliferation of human hepatocellular carcinoma. Liver, 1996;16:123-129

　　［9］ Hino N, Higashi T, Nouso K, Nakatsukasa H, Urabe Y, Kinugasa N. proliferating cell nuclear antigen and grade of malignancy in small hepatocellular carcinoma-Evaluation in US-guided spcimens. hepto-Gastroenterology, 1997;44:245-250

　　［10］ Irene OLN, Edward CSL, Sheung TF, Matthew N, Annie SYC, Mike KPS. prognostic significance of proliferating cell nuclear antigen expression in hepatocellular carcinoma. Cancer, 1994;73:2268-2274

　　［11］ Suehiro T, Matsumata T, Itasaka H, Yamamoto K, Kawahara N, Sugimachi K. clinicopathologic features and prognosis of resected hepatocellular carcinomas of varied sizes with special reference to proliferating cell nuclear antigen. cancer, 1995;76:399-405

收稿日期　1998-08-08　修回日期　1998-11-17