转化生长因子-β1在肝细胞性肝癌中表达增强

世界华人消化杂志 1999年第2期第0卷 专家述评

作者：黄耀煊¹　张桂霞¹　吕民生²　范公忍¹　陈乃玲¹　邬光惠¹

单位：黄耀煊　张桂霞　范公忍　陈乃玲　邬光惠　北京军区总医院　解放军肝病研究所； 吕民生　肝胆外科　　北京市　100700

关键词：肝肿瘤；癌，肝细胞；转化生长因子β1；基因表达；RNA，信使

　　中国图书资料分类号　R735.7

　　摘　要

　　目的　转化生长因子-β1(TGF-β1)在细胞生长的负性调节上有重要作用，是肝细胞生长和增殖的强抑制物 但肝癌(HCC)患者肝组织中TGF-β1 mRNA表达高. 现检测HCC患者外周血中TGF-β1 mRNA表达，血清TGF-β1水平，以及肝组织中TGF-βⅡ型受体(TGF-β-RⅡ)的表达.

　　方法　HCC患者外周血分离单个核细胞(PBMC)，提取总RNA，用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术扩增TGF-β1 mRNA. 血清TGF-β1水平测定用Promega公司产的试剂盒. 肝组织TGF-β-RⅡ表达的分析用原位杂交法.

　　结果　HCC患者20例PBMC TGF-β1 mRNA用RT-PCR检测阳性率达70%，对照组阴性. HCC患者40例血清TGF-β1水平(27.58mg/L±8.10mg/L)明显高于对照组(8.27mg/L±3.72mg/L). 原位杂交表明，TGF-β-RⅡ在HCC细胞的胞质中有弱表达.

　　结论　HCC患者TGF-β1基因在转录水平和翻译水平上均显示表达增强. PBMC有可能代替肝组织用以检测TGF-β1 mRNA的表达应用于基础与临床的研究.

Increased expression of transforming growth factor-β1 in hepatocellular

　　carcinoma

HUANG Yao-Xuan¹, ZHANG Gui-Xia¹, LU Min-Sheng², FAN Gong-Ren¹, CHEN Nai-Ling¹ and WU Guang-Hui¹

　　¹Institute of Hepatology, ²Department of Hepatobiliary Surgery, Chinese PLA General Hospital of Beijing Command Area, Beijing 100700, China

　　Subject headings　liver neoplasms; carcinoma, hepatocellular; transforming growth factor β1; gene expression; RNA, messenger

　　Abstract

　　CONCLUSION　TGF-β1 gene expression is increased in HCC patients both in transcription level and translation level. PBMC may be possibly used instead of tissue section for TGF-β1 mRNA detection in basic and clinical studies.

　　0　引言

　　转化生长因子-β1(TGF-β1)是控制肝脏细胞生长和增殖的一重要细胞因子. 但近年发现在肝细胞癌(HCC)患者肝组织中，TGF-β1 mRNA的表达不是减弱而是增强，并发现原在肝细胞膜上表达的TGF-β1 Ⅱ型受体(TGF-β-RⅡ)改在胞质内见有弱的表达^［1］. 同时发现乙型肝炎病毒(HBV)的x基因(HBx)有激活TGF-β1表达，和降低TGF-β1 Ⅱ型受体(TGF-β-RⅡ)表达的功能^［2，3］. 为了解HCC患者除在肝组织外，是否在外周血中亦能测到TGF-β1 mRNA表达，血清中有生物活性的TGF-β1水平和肝组织中TGF-β-RⅡ表达的改变，以探讨它们之间的关系.

　　1　材料和方法

　　1.1　PBMC TGF-β1 mRNA　本院住院HCC患者20例，男18例，女2例，年龄48岁～53岁，健康成人5例作为对照. HCC患者和健康者对照分别取外周血，用常规淋巴细胞分离液密度梯度离心分离PBMC，用Chomczynski Sacchi法，异硫氰酸胍-酚-氯仿提取总RNA，经电泳鉴定后进行TGF-β1 mRNA的反转录聚合酶链反应(RT-PCR). 第一步先合成cDNA. 反应溶液中含1μg oligodT, dNTP 1mmol/L，RNase 20U和MLV逆转录酶200U，总体积为20μL，在42℃保温反应60min. 第二步进行PCR. 上述反应物取5μL加到反应混合物，中含一对TGF-β1 PCR引物20pmol/L，dNTP 200μmol/L， Taq DNA聚合酶1U及相应缓冲液，总体积50μL. 在PCR仪上93℃变性5min后进入PCR循环，93℃ 45s, 54℃ 45s, 72℃ 60s，循环35次，最后在72℃继续反应7min后放4℃冷却. 扩增产物用20g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定. 引物序列：

　　GCCCTGGACACCAACTATTGCT　1-22

　　AGGCTCCAAATGTAGGGGCAGG　140-161

　　1.2　HCC组织TGF-β1 mRNA　本院住院HCC患者3例手术HCC标本. 从冰冻HCC组织中同上法提取RNA和作TGF-β1 mRNA的RT-PCR.

　　1.3　HCC患者血清中TGF-β1　本院住院的HCC患者40例，男35例，女5例，年龄41岁～60岁. 均为血清HBVM有一项以上阳性者(均未使用过乙型肝炎疫苗). 对照组为本院血库提供的健康供血者25例的血标本. 用美国Promega公司产的TGF-β1 ELISA试剂盒，操作步骤按说明书进行.

　　1.4　HCC肝组织中TGF-β-RⅡ的表达　住院HCC患者3例手术肝癌标本. 用北京医科大学病理室提供的TGF-β-RⅡ原位杂交试剂盒.

　　统计学处理　检测结果以±s表示，组间比较用t检验.

　　2　结果

　　2.1　HCC患者PBMC TGF-β1 mRNA　在所测20例HCC患者中有14例(70%)在PBMC中测有TGF-β1 mRNA的表达，RT-PCR扩增产物电泳图谱显示在相当160bp处有DNA片段区带(图1). 为了比较，HCC组织标本用同法分析TGF-β1 mRNA表达，得到相似结果.

　　2.2　HCC患者血清中TGF-β1　HCC患者40例的血清有生物活性的TGF-β1水平平均值明显高于对照组(P＜0.01，表1)，证明在HCC中，TGF-β1不但在转录水平而且在翻译水平表达明显增加.

表1　HCC患者血清TGF-β1水平

(±s，mg/L)

　　2.3　HCC肝组织中TGF-β-RⅡ的表达　原位杂交试验结果只在HCC细胞的胞质中散见有着色点，表明TGF-β-RⅡ在胞质中有弱的表达(图2).

图1　HCC患者PBMC TGF-β1 mRNA RT-PCR产物　电泳图.

　　1.阴性对照　2.HCC患者PBMC标本1　3.HCC患者PBMC标本2　4.Mr 标准(PBR322-BstNI)

图2　HCC组织TGF-β-RⅡ的原位杂交.

　　3　讨论

　　生长因子与癌变的关系越来越引起研究者的重视. TGF-β1及其受体在HCC中起的作用是很复杂的. TGF-β1是Mr 25000的同质二聚体多肽，以前体形式分泌，单体形式存在，经激活后形成二聚体始获得有生物活性的TGF-β1. 它是负性生长因子，可抑制肝细胞生长，DNA复制. 但Bedossa et al^［1］报道免疫组化分析和原位杂交试验均证明TGF-β1 mRNA在肝细胞有高度表达. 他们认为单用免疫组化分析恐有可能由于肝细胞的摄取，单用原位杂交则不能测出蛋白质的进一步加工或转录后的激活，所以采取两法并用. 我们也考虑到综合分析的重要性，取HCC患者外周血分离PBMC并提取总RNA，用RT-PCR扩增TGF-β1 mRNA并与HCC组织用同法扩增所得的TGF-β1 mRNA进行比较，结果一致显示TGF-β1 mRNA表达增强，同时也表明PBMC有可能以代替肝组织分析TGF-β1 mRNA表达，作为无创伤的观察指标用于研究和临床. 对于基因表达的检测来讲，转录后的翻译和激活的分析是非常重要的，TGF-β1在激活后通过二硫链形成二聚体方具有生物活性. 为此我们在证明HCC组织中TGF-β1 mRNA高表达的同时，对HCC患者血清中具有生物活性的TGF-β1进行定量分析，证明不但在转录水平上而且在翻译水平上，TGF-β1基因在HCC患者中表达得到增强.

　　既然HCC患者高表达TGF-β1，那为什么肿瘤细胞的增长不能得到控制呢对此问题许多研究者感到兴趣，现在有一种解释即TGF-β1的受体有了改变^［1］. 活化的TGF-β1需通过膜受体发挥其效应、受体是介导信号传导的，在细胞表面的Ⅱ型受体即TGF-RⅡ被认为是介导生长抑制信号传导的，Bedossa et al^［1］发现TGF-β-RⅡ不在HCC细胞的表面而在胞质中表达，他们认为这可能干扰了TGF-β1在细胞增殖上的封闭效应，因而癌细胞得以逃避TGF-β1对其增殖的控制. 本结果亦证明，TGF-β-RⅡ在HCC细胞的胞质中弱表达. 至于TGF-β-RⅡ为何会在肿瘤细胞膜上面丢失的问题，除了受体基因可能丢失外，受体基因产生突变导致编码的蛋白产生改变也可能是原因之一^［4］. 此外，日本Oshikawa et al^［2］发现HCC细胞TGF-β-RⅡ量减少，HBx基因起有作用. 将带有HBx基因的重组质粒，转染细胞可使后者在加TGF-β1后DNA合成受抑制的程度明显下降，并证明在这种HBx基因转染的细胞表面TGF-β-RⅡ的量减至对照组的一半. 同年美国国立肿瘤研究所Yoo et al^［3］研究者报告在能表达HBx基因的转基因小鼠中检测到TGF-β1的表达增加，TGF-β1与HBx的表达有很好相关性. 此外还发现在TGF-β1基因转染的肝细胞中HBx可激活TGF-β1基因的转录，他们认为在HBx激活下TGF-β1表达增加与HCC的发生有关. 联系本实验室早些时候的工作^［5］，试验证明HBx在HCC患者肝组织中异常表达. 综合以上所述研究结果，可以看出HBx与HCC、与TGF-β1，与TGF-β-RⅡ都有关系. HBx致癌的机制是复杂的，TGF-β1有可能是机制中重要环节之一.

　　致谢　本文照片系本院摄影室李行忠同志所拍，特此致谢.

　　作者简介：黄耀煊，男，1929-02-09生，福建省福州市人，汉族. 1954年上海第一医学院毕业，1980/1983留学美国，教授，主要从事肝病诊治分子生物学研究，发表论文80篇，合编专著《丙型肝炎》一书，参加编写《肝病免疫学》等专著5部.

　　通讯作者　黄耀煊教授，100700，北京军区总医院解放军肝病研究所，北京市东四南门仓5号.

　　Correspondence to:Prof. HUANG Yao-Xuan, Institute of Hepatology, Chinese PLA General Hospital of Beijing Command Area, 5 Nanmencang, Dongsi, Beijing 100700, China

　　Tel. +86·10·66721629 Ext. 8233

　　4　参考文献

　　［1］　Bedossa P, Peltier E, Terris B, Franco D, Roynard T. Transforming growth factor -beta 1( TGF-β1) receptors in normal, cirrhotic and neoplastic human livers. Hepatology, 1995;21:760

　　［2］ Oshikawa O, Tamura S, Kawata S, Ito N, Tsushima H, Kiso S. The effect of hepatitis B virus x gene expression on response to growth inhibition by transforming growth factor-β1. B.B.R.C, 1996;222:770-773

　　［3］ Yoo YD, Ueda H, Park K, Flanders KC, Lee YI, Jay G. Regulation of transforming growth factor-β1 expression by the hepatitis B virus (HBV) x transactivator. Role in HBV pathogenesis. J Clin Invest, 1996;97:388-395

　　［4］ Samowitz WS, Stattery ML. Transforming growth factor type 2 mutation and microsatellite instability in sporadic colorectal adenomas and carcinomas. Am J Pathol, 1977;151:33-35

　　［5］　黄耀煊，邬光惠，吴霞，范公忍，皋岚湘，王锡育. 原发性肝细胞癌中乙型肝炎病毒X抗原表达的分析. 肝脏病杂志，1995；3：86-88