胎肝提取物对BEL-7402肝癌细胞增殖和分化的影响
世界华人消化杂志 1999年第3期第0卷 研究原著
作者：邹清雁 李茹冰 曾平鲁 杨联萍 陈永振 孔祥平
单位：解放军458医院 解放军传染病中心 广东省广州市 510602
关键词：肝肿瘤；肝提取物；肿瘤细胞，培养的
中国图书资料分类号 R735.2
摘 要
目的 观察4月龄和7月龄胎肝提取物(E4，E7)对BEL-7402肝癌细胞增殖和分化的影响.
方法 采用显微镜下细胞计数，3H-TdR掺入和MTT比色法，观察(10～1000)mg/L的E4和E7对培养中BEL-7402肝癌细胞的影响.
结果 E4从100mg/L起可明显抑制7402细胞的生长和DNA合成，细胞生长抑制IC50为144.4mg/L，DNA合成抑制IC50为227.9mg/L. 在(250～1000)mg/L时对整体细胞线粒体脱氢酶活力有明显的抑制作用，IC50为1013.0mg/L. E7在(10～100)mg/L对细胞生长和DNA合成具有明显的促进作用，至1000mg/L浓度未发现明显的抑制作用. 在500mg/L和1000mg/L浓度时对整体线粒体脱氢酶活力具有一定的抑制作用. 对细胞生长曲线影响，E4表现为500mg/L时能明显抑制7402细胞的生长，而在50mg/L时影响不明显；E7表现为500mg/L时影响不明显，而50mg/L时则有明显的促进作用. (100～1000)mg/L的E4能明显促进单个细胞脱氢酶的活力，而E7只在1000mg/L时有一定的促进作用，在(10～50)mg/L对额定细胞脱氢酶活力有一定的抑制作用.
结论 胚胎发育早期，分化占优势，体内合成较多的促分化因子；胚胎晚期，组织生长活跃，从而产生较多的促生长因子.
Effect of embryo hepatic extracts on proliferation and differentiation of hepatoma BEL-7402 cells
ZOU Qing-Yan, LI Ru-Bing, ZHENG Ping-Lu, YANG Lian-Ping, CHEN Yong-Zhen and KONG Xiang-Ping
Infectious Disease Center of Chinese PLA, 458 Hospital, Guangzhou 510602, Guangdong Province, China
Subject headings liver neoplasms; hepatic extracts; tumor cell, cultured
Abstract
AIM To investigate the effect of the hepatic extracts (E4,E7) from 4-and 7-month old embryos on BEL-7402 hepatoma cell proliferation and differentiation in vitro.
METHODS The effects of (10-1000)mg/L E4 and E7 on BEL-7402 hepatoma cells in culture were investigated by cell counting under microscope, 3H-TdR incorporation and MTT colorimetric assay.
RESULTS E4 obviously inhibited the proliferation and DNA synthesis of BEL-7402 hepatoma cells at (100-1000)mg/L concentrations, their half inhibitory concentrations (IC50) were 144.4mg/L and 227.9mg/L respectively. E4 also inhibited the total activities of mitochondrial dehydrogenase at (250-1000)mg/L,the IC50 was 1013.0mg/L. E7 evidently promoted the proliferation and DNA synthesis of the cells at (10-100)mg/L,and had no remarkable inhibitory effects until up to 1000mg/L, and also inhibited the total activities of dehydrogenase at (500-1000)mg/L. E4 inhibited significantly the cell growth curve at 500mg/L and had no apparent effects at 50mg/L;while E7 had no remarkable effect on the cell growth curve at 500mg/L, and showed an obviously promoting effect at 50mg/L. E4 at (100-1000)mg/L apparently promoted the dehydrogenase activities of a single cell. Only at 1000mg/L did E7 have such promoting effects, at (10-50)mg/L E7 had an obviously inhibitory effect on the mitochondrial dehydrogenase activity of definite number of hepatoma cells.
CONCLUSION The embryonic cells express more differential factors to fit their differentiation at the early period, and cells produce more growth factors to fit their rapid proliferation at the late period.
0 引言
恶性肿瘤的诱导分化治疗是近年来肿瘤生物学和治疗学的研究热点［1］. 研究表明，4月龄胎肝提取物中可能有肝生长抑制因子和促分化因子［2］. 为了动态观察胚肝发育过程中分化因子的生物学活性，我们选用4，7月龄胎肝，同时制备提取物，观察它们对BEL-7402细胞的影响.
1 材料和方法
1.1 材料 ①胎肝提取物的制备［2］：取4月龄和7月龄水囊引产的胎肝(HBsAg(-))，按文献［2］的方法制备提取物，分别称4，7月龄胎肝提取物(embryonic liver extracts, E4,E7). -20℃保存，蛋白含量采用Lowry法测定［3］. ②药品和试剂：溴化噻唑蓝四氮唑(MTT为Jansson Chimica产品)，F12培养基为Sigma产品，二甲亚砜(DMSO)为Farco产品，胰酶为Serva产品，3H-TdR，37GBq/L购自中国科学院原子能研究所. BEL-7402细胞，引自香港中文大学. F12培养液，含100mL/L小牛血清，青链霉素各100kU/L，37℃，50mL/L CO2传代培养，贴壁细胞实验用胰酶消化.
1.2 方法 胎肝提取物对BEL-7402细胞的影响：细胞浓度为(4～8)×107/L接种于96孔培养板，0.1mL/孔，置37℃，50mL/L CO2 24h后换液，加入(10～1000)mg/L的E4或E7，以10g/L DMSO为分化阳性对照，设阴性对照孔. 分别于24，48，72h在倒置显微镜下计数细胞，以细胞数/cm2表示，计算细胞的生长曲线. 72h后弃上清. 96孔板加含0.15g/L MTT和2mCi/L 3H-TdR F12培养液0.05mL. 培养4h，分别做MTT比色［4］和3H-TdR 掺入的技术操作［5］. 额定细胞数脱氢酶活力相对值(relative value，R值)采用以下公式计算：R值=A(OD值)/相应细胞数×104，以反映每104个细胞脱氢酶相对的活力.
统计学处理 所有数据均行方差分析，Dunnett法和对数直线回归计算半数抑制浓度(IC50).
2 结果
2.1 对细胞增殖和DNA合成的影响 50mg/L的E4对7402细胞的生长曲线影响不明显，而500mg/L的E4可明显抑制7402细胞的生长. 50mg/L的E7在24h对7402细胞有轻微的促生长作用，在48h和72h细胞数量明显增加，而500mg/L的E7对细胞生长曲线有轻微的抑制作用(图1). 10g/L DMSO对细胞生长曲线也有一定的抑制作用. E4对7402细胞增殖的半数抑制IC50为144.4mg/L，E7的IC50大于1000mg/L (表1). E4对7402细胞DNA合成的半数抑制浓度IC50为227.9mg/L，而E7的DNA合成IC50测不出(表2).
图1 胎肝提取物对BEL-7402细胞生长曲线的影响.
表1 胎肝提取物对7402细胞增殖的影响
(
±s，n=4)
| (p/mg·L-1) |
E4 |
E7 |
| n |
细胞数(×104/cm2) |
n |
细胞数(×104/cm2) |
| 1000 |
6 |
0.15±0.07b |
4 |
0.71±0.25 |
| 500 |
5 |
0.19±0.05b |
2 |
1.22±0.44 |
| 250 |
4 |
0.30±0.08b |
1 |
1.52±0.58 |
| 100 |
3 |
0.76±0.13a |
1 |
1.95±0.60 |
| 50 |
1 |
1.51±0.30 |
3 |
2.89±0.82a |
| 25 |
2 |
3.02±0.38b |
4 |
3.13±0.85b |
| 10 |
1 |
2.71±0.83b |
2 |
2.62±0.61a |
| DMSO |
|
1.14±0.48 |
| 对照组 |
|
1.64±0.33 |
| F值 |
|
26.12 |
|
7.10 |
aP＜0.05，bP＜0.01，vs 对照组.
表2 胎肝提取物对7402细胞DNA合成的影响
(±s，n=4)
| (p/mg·L-1) |
E4 |
E7 |
| n |
min-1 |
n |
min-1 |
| 1000 |
6 |
111±27 |
1 |
556±62 |
| 500 |
5 |
172±77b |
2 |
622±159 |
| 250 |
3 |
235±38b |
3 |
674±131 |
| 100 |
2 |
365±82a |
5 |
1009±231a |
| 50 |
1 |
483±93 |
7 |
1333±322b |
| 25 |
1 |
642±145 |
6 |
1282±316b |
| 10 |
2 |
721±167a |
4 |
976±174a |
| DMSO |
241±141 |
| 对照组 |
|
544±74 |
| F值 |
|
7.36 |
11.40 |
aP＜0.05，bP＜0.01，vs 对照组.2.2 对细胞线粒体脱氢酶活力的影响 DMSO能抑制细胞内脱氢酶的活力，抑制率为43.3%. E4在浓度为(250～1000)mg/L对酶活力有明显的抑制作用，IC50为1013.0mg/L，当浓度为10mg/L时具有一定的促进作用. E7在浓度为(500～1000)mg/L时对酶活力有抑制作用，当浓度为25mg/L时具有促进作用(表3). E4，E7对每104个细胞脱氢酶活力的影响见表4.
表3 胎肝提取物对整体7402细胞脱氢酶活力的影响
(±s，n=4)
| (p/mg·L-1) |
E4 |
E7 |
| n |
A(×10-3) |
n |
A(×10-3) |
| 1000 |
6 |
107±17b |
2 |
172±15a |
| 500 |
4 |
171±25b |
1 |
186±13a |
| 250 |
3 |
185±31a |
2 |
263±20 |
| 100 |
2 |
210±23 |
1 |
259±30 |
| 50 |
1 |
230±10 |
4 |
290±42 |
| 25 |
2 |
264±38 |
5 |
303±24a |
| 10 |
2 |
284±37a |
3 |
268±41 |
| DMSO |
|
136±32 |
| 对照组 |
|
240±31 |
| F值 |
|
14.53 |
|
20.56 |
aP＜0.05，bP＜0.01，vs 对照组.
表4 胎肝提取物对额定细胞脱氢酶活力的影响
(±s，n=4)
| (p/mg·L-1) |
E4 |
E7 |
| n |
R(×10-3) |
n |
R(×10-3) |
| 1000 |
4 |
713±113b |
3 |
242±21a |
| 500 |
5 |
880±129b |
1 |
153±11 |
| 250 |
3 |
610±102b |
2 |
173±13 |
| 100 |
2 |
270±35a |
1 |
133±15 |
| 50 |
1 |
150±7 |
3 |
101±15b |
| 25 |
3 |
87±13 |
5 |
97±8b |
| 10 |
2 |
105±14 |
4 |
103±16b |
| DMSO |
1 |
120±28 |
2 |
120±28 |
| 对照组 |
|
146±19 |
|
146±19 |
| F值 |
|
158.4 |
|
64.35 |
aP＜0.05，bP＜0.01，vs 对照组.
3 讨论
恶性肿瘤细胞在形态、功能和代谢等方面类似未分化的胚胎细胞，在分化诱导剂的存在下，肿瘤细胞可以出现逆转或再分化［6］. 诱导肝癌细胞分化的因素很多，如维甲酸［1］、阿霉素［7］、二甲亚砜［8］等. 我们研究发现，4月龄胎肝提取物可以明显地抑制BEL-7402肝癌细胞的生长，形态上出现与DMSO作用后相似的分化改变，提示4月龄胎肝提取物中含有促进BEL-7402细胞分化的活性物质. 新生小牛肝和胎肝提取物能促进大鼠再生肝细胞的增殖［9，10］. 本结果表明：7月龄胎肝提取在(10～100)mg/L浓度时对BEL-7402细胞的生长和DNA合成有明显的促进作用，4月龄胎肝提取物在低浓度时对细胞增殖也有一定的促进作用(表1，2；图1). 提示，胎肝提取物有促肝癌细胞生长的活性物质，而以7月龄胎肝提取物的促生长活性较高.
MTT比色法常用于体外评价抗癌药物活性［7］，其原理是通过检测细胞内线粒体脱氢酶的活力来反映细胞的生存活力［4］. 线粒体琥珀酸脱氢酶是细胞有氧化谢的中间酶，分化程度高的肿瘤细胞有氧化谢活跃，而分化程度低的细胞糖酵解代谢活跃. 本结果表明，(100～1000)mg/L的E4能增强额定细胞脱氢酶的活力，说明E4能增强单个细胞的有氧代谢功能和促进分化. E7的作用相对较弱，只有1000mg/L才能起到促进分化的作用； 当浓度为(10～50)mg/L对细胞有氧代谢有一定的抑制作用(表4). 胚胎自受精卵发育演变而来，期间涉及到受精卵的增殖、分裂和分化. 人胚前3mo，细胞以分化增殖为主，胚胎晚期，细胞以生长增殖为主，其间会产生相应的生长和分化活性物质. 本研究结果表明，4月龄胎肝提取物中含有较多的增殖抑制因子和促分化因子，而7月龄胎肝提取物中促肝癌细胞生长增殖的活性较高. 提示，胚胎发育早期，体内促分化因子活性高，胚胎晚期，机体产生较多的促生长因子以适应胚胎的生长发育. 生长因子、抑制因子和分化因子共同组成了细胞因子网络，调控着细胞的生长、发育和死亡，组成了细胞稳态平衡的矛盾统一体. 胎肝提取物中，包含有许多生长因子、生长抑制因子和分化因子［2,9-11］，随着肝分化因子研究的深入，必将给肝肿瘤的生物治疗提供一条新途径.
作者简介：
邹清雁，男，1966-03-15生，湖南新化人，汉族. 1986年第一军医大学医疗系毕业，1989年第一军医大学组织胚胎学专业硕士，副主任医师，从事肝脏疾病，肝癌等基础研究，发表论文15篇.
通讯作者 邹清雁，510602，解放军458医院 解放军传染病中心，广东省广州市.
Correspondence to:ZOU Qing-Yan, Infectious Disease Centre of Chinese PLA, The 458 Hospital, Guangzhou 510602, Guangdong Province, China
Tel. +86·20·87378532
4 参考文献
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［2］ 邹清雁，孔祥平，李茹冰. 胎肝提取物对BEL-7402肝癌细胞的影响. 临床肝胆病杂志，1997；13：225
［3］ Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL. Protein measurement with the folin phenol reagent. J Biol Chem, 1951;193:265-275
［4］ 邹清雁，孔祥平，张宜俊. 乳猪脑提取物和脑活素对培养中胎鼠大脑皮层神经元的影响. 天津医药，1994；11：661
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［9］ 邹清雁，向亚玲，陈德元. 小牛和大鼠肝生长刺激因子的提取及其对大鼠肝部分切除后肝细胞增殖的影响. 解剖学杂志，1992；15：179
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收稿日期 1998-11-10
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