α-转化生长因子及其受体在人原发性肝细胞肝癌中的表达意义

世界华人消化杂志 1999年第11期第7卷 研究原著

作者：张　静　王文亮　李　青　乔　庆

单位：中国人民解放军第四军医大学病理学教研室　陕西省西安市　710033

关键词：α-转化生长因子(TGF-α)；表皮生长因子受体(EGF-R)；肝细胞肝癌(HCC)；免疫组织化学/ 多重PAP法；原位杂交

　　摘要　目的　探讨α-转化生长因子(TGF-α)及其受体——表皮生长因子受体(EGF-R)在人原发性肝细胞肝癌(HCC)组织蛋白和分子水平上的表达及意义.　方法　运用免疫组织化学和原位杂交方法对70例HCC进行研究，并采用5例正常人类肝脏做为对照.　结果　①70例HCC中TGF－α的阳性率为74.3%；EGF-R的阳性率为38.6%. ②TGF-α与HCC的分化程度有关(P＜0.05)，在高分化HCC中TGF-α的阳性率明显高于低分化的HCC. ③有93.6%的EGF-R阳性组织同时表现为TGF-α阳性，二者的表达在HCC组织中呈显著正相关(P＜0.05，γ=0.40). ④在HCC癌旁组织中，TGF－α的阳性率为88.1%，EGF-R的阳性率为54.2%，与其在HCC组织中相比，无显著差异(P＞0.05)，TGF-α与EGF-R呈显著正相关(P＜0.05，γ=0.35). ⑤TGF-α与EGF-R的原位杂交结果略高于免疫组织化学结果，但二者之间无显著差异(P＞0.05).　结论　TGF-α，EGF-R可能与HCC的发生有关，在HCC发生中可能存在TGF-α的自泌循环，使TGF-α，EGF-R呈高表达，而高表达的TGF-α，EGF-R又是致使HCC发生的重要因素，但在HCC晚期，可能存在其他因素使TGF-α的基因表达受抑制. 本结果将有助于临床对HCC患者的预后分析.

　　中国图书馆分类号　R 735.23

Expression and significance of transforming growth factor-α and its receptor in human primary hepatocellular carcinoma

ZHANG Jing, WANG Wen-Liang, Li Qing and QIAO Qing

　　Department of Pathology, Fourth Military Medical University, Xi＇an 710033, Shaanxi Province, China

　　Abstract　AIM　To evaluate the expression and significance of transforming growth factor (TGF-α) and its receptor-epidermal growth factor receptor (EGF-R) in human hepatocellular carcinoma (HCC).　METHODS　Seventy specimens of HCC were detected by repeated PAP and in situ hybridization. Five specimens of normal human livers were used as control tissues.　RESULTS　① TGF-α appeared mainly in cytoplasm of tumor cells in 74.3%. EGF-R was detected in cytoplasm of tumor cells in 38.6%. ② In those cases, TGF-α had relationship with differentiation of tumor (P＜0.05). Staining in more highly differentiated tumors was usually more intense than in the less differentiated tumor. ③ 26 of 27 specimens in which EGF-R was detected appear TGF-α positive at the same time. There was prominently positive correlation between TGF-α and EGF-R immunoreactivity (P＜0.05，γ=0.40). ④ In peri-HCC tissues, TGF-α and EGF-R were expressed in 88.1% and 54.2%. No difference between HCC and its peripheral tissues (P＞0.05) was found. There was prominently positive correlation between TGF-α and EGF-R (P＜0.05，γ=0.35). ⑤ In situ hybridization showed that the levels of TGF-α and EGF-R mRNA were higher than those of immunohistochemistry. But no significant difference was detected between two methods.　CONCLUSION　HCC in early stages may be under the autocrine regulation of TGF-α and its receptor—EGF-R. Increased expressions of TGF-α and EGF-R may be events of human primary hepatocarcinogenesis. In the later stages, may have some other factors which decreased expression of TGF-α. This data will help us to presume the curing of HCC.

　　Subject headings　transforming growth factor (TGF-α); epidermal growth factor receptor (EGF-R); hepatocellular carcinoma (HCC); immunohistochemistry/ repeated PAP; in situ hybridization

　　0　引言

　　α-转化生长因子(TGF-α)是由50个氨基酸组成的多肽，具有促进细胞生长和转化能力，在结构上与表皮生长因子有30%～40%的同源性. 除在早期的胚胎发育中存在外，正常肝组织内几乎无TGF-α mRNA的表达^［1］，而许多肿瘤细胞系产生TGF-α的事实，说明它在异常细胞转化中起有重要的作用. 其受体——表皮生长因子受体(EGF-R)是自身具有酪氨酸蛋白激酶活性的糖蛋白，它可通过与配体(EGF，TGF-α)结合，使其自身磷酸化，从而发挥生物学效应. 现已发现，EGF-R在源于肿瘤转化细胞中的表达较高，并与c-erbB等癌基因关系密切^［2］. 我们用免疫组织化学和原位杂交的方法对人原发性肝细胞肝癌(HCC)患者肝组织内的TGF-α，EGF-R的分布和表达进行了研究.

　　1　材料和方法

　　1.1　材料　HCC标本70例取自1988/ 1995西京医院手术切除标本，5例正常组织取自尸检组织(已排除肝脏疾病). 全部标本经100 mL/ L中性福尔马林液固定，石蜡包埋，常规连续切片，厚5 μm. HE染色，病理诊断证实. HCC参照WHO标准分为3级：Ⅰ级为高分化HCC；Ⅱ级为中分化HCC；Ⅲ级为低分化HCC. 鼠抗TGF-α，EGF-R单克隆抗体购自美国Santa Cruze Biotechnology, Inc; TGF-α，EGF-R探针购自美国Zymed公司；鼠PAP购自武汉生物制品研究所；桥抗由第四军医大学病理学教研室提供；Dig DNA Labeling and Detection Kit购自德国宝灵曼IBM公司.

　　1.2　方法　①多重PAP法：石蜡切片常规脱蜡至水，1 mL/ L H₂O₂去除内源酶活性40min；40%正常羊血清37℃封闭1 h；分别加入工作浓度的TGF-α，EGF-R单克隆抗体4℃孵育48 h～72 h；加桥抗37℃ 1 h，鼠PAP 37℃ 1 h，重复加桥抗、PAP的步骤3次，每两次为一染色循环，每增加两个PAP，DAB显色1次. 对照实验：用正常鼠血清或PBS替代一抗做阴性对照，并有正常肝脏组织作为对照. 结果判定：标本无阳性反应细胞、阳性反应细胞率＜10%或背景同阳性对照者为阴性(-)；标本阳性细胞呈淡棕黄色或阳性细胞率介于10%～50%为弱阳性(+)；标本阳性细胞呈深棕黄色或阳性细胞率大于50%为强阳性(++). ②探针标记：将1 μg线性化DNA变性后与3 μL六聚核苷酸引物及3 μL dUTP标记混合物混合，加三蒸水至19 μL，再加入1 μL Klenow酶；短暂离心，37℃孵育16 h；加入3 μL 0.2 mol/ L EDTA (pH 8.0)终止反应，加入2.5 μL 4mol/ L LiCl，75 μL -20℃预冷的乙醇，混匀后置-20℃过夜；12 000 g离心10min，700 mL/ L冷乙醇洗涤沉淀，真空抽干；50 μL TE (pH 8.0)，37℃溶解30min，置于-20℃备用. ③原位杂交：石蜡切片常规脱 蜡至水，于1 mL/ L DEPC-PBS中浸泡10min；0.2 mol/ L HCl处理30min；40 mL/ L 多聚甲醛-PBS后固定20min；2 mL/ L甘氨酸洗5min×2；0.1 mol/ L三乙醇胺缓冲液振洗5min；2 mL/ L醋酸酐-0.1 mol/ L三乙醇胺缓冲液处理10min；含0.3 mol/ L醋酸胺的梯度酒精脱水，室温晾干；加杂交液(变性探针300 μg/ mL)于湿盒中，37℃ 24 h～48 h；依次在2×SSC，1×SSC，0.5×SSC中各振洗15min×4，三蒸水洗15min；Buffer Ⅰ中振洗5min×2；加入封闭液封闭30min；用封闭液按1∶500稀释标记的Dig抗体，作用切片于湿盒中37℃ 2 h～3 h；Buffer Ⅰ振洗15min×2；Buffer Ⅱ洗片30s；45 μL NBT， 35 μL BCIP溶于10 mL Buffer Ⅲ中(显色前配制)，混匀后滴加在切片上，避光显色2 h～8 h；浸入TE(pH 8.0)中终止显色；常规脱水、透明、封片. 对照：设置不加探针的空白及正常对照.

　　统计学处理　采用χ²检验，P＜0.05为显著差异，P＜0.01为非常显著，P＞0.05为无差异. TGF-α与EGF-R间行相关性分析.

　　2　结果

　　2.1　HCC中TGF-α，EGF-R的表达　在70例HCC组织中，多重PAP染色显示TGF-α的阳性率为74.3%，阳性细胞多呈弥漫型分布，少数病例呈灶状分布，阳性物质为棕黄色、颗粒状，主要弥漫分布于癌细胞的胞质中，少数或(和)位于核膜上(见图1). 多重PAP染色显示EGF-R阳性的表达率为38.6%，阳性细胞多呈弥漫型分布，阳性颗粒主要位于癌细胞胞质中(见图2). TGF-α的表达与HCC的分化程度关系密切，TGF-α在高分化的HCC中的阳性率明显高与中、低分化的HCC(P＜0.05，见表1). 有96.7%的EGF-R阳性的组织同时表现为TGF-α阳性，且二者存在显著正相关(P＜0.05，γ=0.40).

图1　在HCC组织中，TGF-α阳性颗粒呈棕黄色，位于癌细胞胞质中，少数位于核膜上. PAP　400×

图2　在HCC组织中，EGF-R阳性颗粒呈棕黄色，位于癌细胞胞质中.PAP　400×

表1　TGF-α与HCC分级间的关系

　　^*P＜0.05，vs Ⅱ，Ⅲ级，χ²=9.11.

2.2　癌旁组织中TGF-α，EGF-R的表达　癌旁组织中TGF-α的阳性率为88.1%，阳性物质常可见于增生活跃或(和)不典型增生的肝细胞中(核大或呈双核，核仁突出或不规则，核/质比例增高等). 在25例癌旁为肝硬变组织中，TGF-α的阳性率为84%，其中9例坏死后肝硬变组织中TGF-α 8例为阳性，阳性率为88.9%，两者间检出率无显著差异(P＞0.05). 部分病例中，胆管上皮呈TGF-α强阳性反应(其中大部分为增生的胆管上皮细胞). eGF-R的阳性率为54.2%. TGF-α和EGF-R在癌旁中的阳性率分别与HCC相比，无显著差异(P＞0.05). tGF-α与EGF-R在癌旁组织中呈显著正相关(P＜0.05，γ=0.35). 对照：5例正常肝组织除个别胆管上皮细胞有TGF-α，个别肝细胞有EGF-R的微弱表达外，余均为阴性. 用鼠血清和PBS取代一抗的组织均无阳性反应可见.

　　2.3　原位杂交结果　TGF-α mRNA，EGF-R mRNA杂交阳性物质为蓝紫色、细颗粒状物，弥漫性分布，主要位于胞质中(见图3，4)，原位杂交结果与免疫组织化学结果相比略高，但二者之间无显著差异(P＞0.05).

图3　HCC组织中，TGF-α mRNA阳性颗粒为蓝紫色，位于癌细胞胞质中. ISH　400×

图4　HCC组织中，EGF-R mRNA阳性颗粒为蓝紫色，位于癌细胞胞质中. ISH　400×

　　3　讨论

　　TGF-α是一种参与调节正常细胞和肿瘤细胞增殖和分化的细胞因子. 用异种的TGF-α基因建立的转基因鼠可导致HCC的发生^［3］，Chuang et al^［4］在HCC患者的尿液中也发现了TGF-α，EGF-R的存在，这都表明TGF-α与HCC有重要关系. 在本实验中，我们检测到TGF-α，EGF-R在HCC患者的肝组织中存在高水平的表达，也支持以往的结论. 英国曾有报道仅28%的HCC组织中有TGF-α的表达^［5］，而我们报道TGF-α在HCC组织中的阳性率高达74.3%，这可能与中国的乙型肝炎发病率较高有关，因为转染乙型肝炎病毒(HBV)的人类肝细胞肝癌系可增加TGF-α的表达^［6］. 另外，我们还发现TGF-α与HCC的分化程度关系密切：高分化的HCC的TGF-α的阳性率明显高于低分化的HCC. 据此推测：高浓度的TGF-α可能是HCC发生早期的致癌因素之一，而在晚期可能存在其他的致癌因素抑制了TGF-α的基因表达. 此结果可能有助于临床对HCC患者的预后分析.

　　EGF-R存在于人体的各种组织中，它可与某些转化蛋白(癌基因产物)具有在酪氨酸残基上磷酸化蛋白的能力，而酪氨酸蛋白激酶可能是调节细胞生长的重要环节. eGF-R还能与c-erbB₂、P⁵³等癌基因协同作用^［7］，因此一些学者认为它与某些肿瘤的发生有关. 本组EGF-R的阳性率为38.6%，而在正常肝组织中仅有个别细胞微弱表达，说明EGF-R与HCC的关系密切.

　　根据TGF-α，EGF-R在HCC及癌旁组织中的表达均明显升高，并且在EGF-R阳性的组织中TGF-α几乎同为阳性，二者呈显著正相关的结果. 我们认为，在HCC的发生中可能存在着TGF-α的自泌循环，细胞产生内源性的多肽生长因子——TGF-α作用于自身的功能受体——EGF-R，从而表达其功能，致使细胞向恶性转化，而发生转化的细胞又可分泌TGF-α，因而引起了TGF-α和EGF-R的高表达，使肿瘤细胞形成不可抑制的生长. 此现象已在结肠癌细胞系中得到证实^［8］，同时这也说明TGF-α是通过与EGF-R的结合而完成使正常细胞向肿瘤细胞的转化这一过程.

　　此外，TGF-α在肝内胆管(其中一部分为增生的胆管)上皮细胞中为阳性，结合以往有人发现在胚胎发育和成人肝脏发育时，肝内胆管有TGF-α表达的报道^［9］，我们认为TGF-α可能在肝内胆管形态发生和再生中起有重要的作用.

　　通记作者　张静，710033，陕西省西安市长乐西路17号，中国人民解放军第四军医大学病理学教研室.

　　作者简介：张静，女，1970-02-22，辽宁省沈阳市人，汉族. 1994年第四军医大学毕业，1997年第四军医大学病理学硕士，在读博士研究生，主要从事肝细胞肝癌的病因学及治疗的研究.

　　Correspondence to:ZHANG Jing, Department of Pathology, Fourth Military Medical University, Xi＇an 710033, Shaanxi Province, China

　　Tel. +86·29·2521357(H),3374541 Ext.324(O)

　　Email. jzhang@fmmu.edu.cn

　　4　参考文献

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　　9 Terada T, Ohta T, Natanuma Y. Expression of transforming growth factor-alpha and its receptor during liver development and maturation. Virchows Arch, 1994;424:669-679

收稿日期　1999-09-22