5-脱氧杂氮胞苷抑制肝癌细胞株生物学行为的机制

世界华人消化杂志 2000年第4期第8卷 研究原著

作者：刘丽华　肖文华　杨金亮

单位：刘丽华（中国人民解放军兰州军区总医院消化科 甘肃省兰州市 730051）　;肖文华　杨金亮（中国人民解放军第三军医大学附属西南医院消化科 重庆市 400038）

关键词：肝肿瘤细胞株SMMC-7721；HePG2；5-脱氧杂氮胞苷；甲基转移酶；p16基因；甲基化

　　摘　要：目的 dNA甲基化模式的改变伴随着永生性细胞系的确立，生长凋控基因CpG岛的重新甲基化可能导致了其转录的不活跃，在体外培养的情况下，使得肿瘤细胞选择了有利于生长的条件．我们用DNA甲基转移酶抑制剂5-脱氧杂氮胞苷处理两株肝癌细胞，研究其对肝癌细胞的影响，探讨DNA甲基化异常与肝细胞癌间的相关性及5-脱氧杂氮胞苷对肝癌细胞株恶性生物学行为的影响及其机制。方法用5-脱氧杂氮胞苷处理肝癌细胞株SMMC-7721和HePG2，然后采用相差显微镜观察药物处理前后细胞的形态变化，采用MTT法观察细胞的生长速度变化，采用流式细胞仪检测细胞周期、细胞凋亡率、P16蛋白表达的变化．采用RT-PCR法比较p16和甲基转移酶mRNA表达量的变化，比较裸鼠致瘤性的大小。结果5-脱氧杂氨胞苷处理后细胞形态趋于规则，生长速度减慢．SMMC-7721细胞，G1期细胞增加了8.5％，而s期和G2／M期细胞分别减少了47．8％和10.4％．HePG2细胞，G1期细胞增加了3．5％，S期减少了46．2％．G2／M期增加了23．7％．两细胞凋亡率分别增加了91．6％和133．3％．P16蛋白表达分别增加了23．4％和20.9％，p16mRNA表达增高，而DNA甲基转移酶mRNA表达明显降低，裸鼠皮下移植瘤生长减慢。结论肝细胞癌的发生与DNA甲基化异常有关，甲基化酶抑制剂5-脱氧杂氮胞苷可能通过抑制甲基转移酶抑制抑癌基因启动子区域的高甲基化，恢复其生长调控功能，从而使肝癌细胞株的恶性生物学行为发生逆转。

Effects of5-Aza-2'-deoxycytidine on growth of human hepatocellular carcinoma cell lines

Li Hua Liu(Deparrment of Gastroenterology,General Hospital of PLA,Lanzhou 730050,Gansu province,China)

　　wen Hua Xiao ,Jin Liang Yang(Department of Gastroenterology,Gastroenterology,Southwest Hospital,Third military Medical University,Chongqing 400038,China)

　　Abstract：AIM in order to analyse the correlation between DNA methylation alternation end hepatccellular carcinoma cell lines,two hepatoma cell lines HePG2 end SMMC-7721 wereexposed to the agent 5-Aza-2'-deoxycytidine to study the effects of5.Aza-2'-deoxycytidine on the growth of two cel llines.METHODS Cell morphology, growth speed, cell cycle distribution, apoptotic rate, expression of pl6 mRNA and protein, expression of methyltransferase mRNA and tumorigenicity in nude mice of SMMC-7721 and HepG2 cells after treatment with 5.Aza-2'-deoxycytidine were observed under phase contrast microscope, MTT assay, flow cytometer and rT-PCR.RESULTS HepG2 and SMMC-7721 cells after treatment with5-Aza-2'-deoxycytidine displayed that supermicro structure inclined to normal and a slowed growth. In SMMC-7721 cells, G1 increased by 8.5%, S and G2 + mdecreased by 47.8% and 10.6%, and apoptotic rate increased by 91.4%. In HePG2 cells, G1 increased by 3.5%, S decreased 46.2%, G2+M increased 31%, and apoptotic rate increased 123.1%. The expression of p16 mRNA end protein increased, but the expression of methyltransferase mRNA decreased in two cell lines.Tumorigenicities in nude mice were Iow.CONCLUSION Hepatocellular carcinoma is associated with alternation of DNA methylation. 5-Aza-2'-deoxycytidine, as a well-established inhibitor of DNA methylation, may slow the growth of tumor cells by inhibited DNA methyltrensferase and reactivating growth-regulatory penes silenced by de novo methylation and genes silenced by promoter hypermathylation (such as tumor suppressor pi6 gene). This provides a new approach for tumor therapy by inhibition of mothlyltransferase.

　　Keywords：carcinoma hepatocellular; cell line SMMC-7721; cell line HePG2; 5-Aza.2';deoxycytidine; methyltransferase;p16 gene;mathylation

　　0引言肝癌的发生与许多基因的异常改变有关[1]，尤其与肿瘤抑制基因p16这一重要的细胞周期调控基因的失活有关[2]，其失活的一个重要机制是启动子区域的异常甲基化[2-4]，这种异常甲基化的发生又与甲基转移酶的增高密切相关[5]．在其他肿瘤及肿瘤细胞系的研究中发现，甲基转移酶抑制剂5-脱氧杂氮胞苷能够使甲基转移酶表达降低，使因异常甲基化而转录静止的生长调控基因恢复其转录活性[6]．因此，我们采用5-脱氧杂氮胞苷处理肝癌细胞株SMMC7721，HepG2，观察其恶性生物学行为的变化，分析其机制，以期进一步探讨肝癌发生的机制并寻拔肝癌治疗的新方法．1材料和方法1．1肝癌细胞株培养、药物处理及形态学观察人肝癌细胞株SMMC-7721和HepG2，均培养于含100mL/L小牛血清、100KU／L青霉素，100KU／L链霉索的RPMI-1640培养液中，培养条件为37℃，饱和湿度，50mL／LCO2，每3d～4d消化传代1次，两细胞株按3×105／瓶(100mL)，接种两瓶，24h后，用5×10-7mol／L的5-脱氧杂氮胞苷(Sigma公司，美国)处理[6]，24h后弃去药液，换新鲜培养液，继续培养9d，用于下面的实验，并用光学显微镜观察细胞形态变化．1．2MTT法绘制生长曲线药物处理前后的细胞继续培养9d后，按3×103个/孔(0．2mL)接种于96孔培养板上每3孔为一组，共接种7板．每日取出一板，弃去培养液，生理盐水漂洗一遍，每孔加MTT5g／L培养液100μL，继续培养4h后，弃上清，生理盐水轻洗两遍，加DMSO200μL/孔，产生蓝色结晶，振荡器振荡10min充分使结晶溶解，置酶联免疫检测仪上测定波长570nm下的A(OD值)．最后以A为纵坐标，以时间(d)为横坐标绘制生长曲线．1．3流式细胞仪检测细胞周期，细胞凋亡率及P16蛋白表达取l×l06个对数生长期单细胞悬液用0．01mol／L，pH7．4的PBS洗涤后700mL／L-冷乙醇4℃固定24h以上，碘丙啶(PI)染色，应用流式细胞检测细胞周期、凋亡细胞率．P16抗体(Santacruz公司，美国)，采用免疫荧光间接标记法，检测P16蛋白表达．1．4RT-PCRRNA提取采用Tripure试剂盒(EoehringerMannheim公司，德国)，按说明书进行.RT-PCR采用一步—管法(AcessRT-PCR，system．Promega公司，美国)．甲基转移酶引物(上海生工生物工程公司合成，PAG纯化)PI：5'-ATCTAGCTGC-CAAACGGACG-3',P2：5'-CACTGAATGCACTG-GCAGG-3扩增片段长度为192bp．反应体系为：总体积25μL，dNTP0.2mmol／L，上下游引物各1mmol／L，MgSO41mmol／L，AMV逆转录酶0．1KU／L，TflDNA聚合酶0.1KU／L，1×反应缓冲液，RNA模板100ng，扩增条件为48℃，45min→94℃，2min→94℃，30s；56℃，60s；72℃，90s；40cycles→68℃，7min．P16引物为P1：5'-AGCCTTCGGCT-GACTGGCTGG-3'，P2：5'-CTGCCCATCATCATGACCTGGA-3，扩增片段长度为428bp，反应体系同甲基转移酶，扩增条件为48℃，45min→94℃，2min→94℃，30s：60℃；45s；68℃，90s；40cycles→68℃，7min．GAPDH(作为外参照)引物为P1：5'-CCACCCATG-GCAATTCCATGGCA-3',p2:5'-TCTAGACG-GCAGGTCAGGTCCAC-3'，扩增片段长度为598bp．反应体系同前，扩增条件为48℃，45min→94℃，2min→94℃，30s；60℃，40s；68℃，60s；40crcles→68℃，7min．取3μL-6μL扩增产物行20g／L琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察并拍照。1．5裸鼠致瘤性实验Balb／c裸鼠，，4周龄， 3只／组，生长状况良好的细胞消化，计数，培养液洗涤两遍后，0．1mL无血清培养液悬浮,分别于裸鼠左、右侧背部皮下注射5x106未用药物处理的细胞和药物处理后的细胞，连续4wk察出现的时间和体积。2结果2．15-脱氧杂氮胞苷处理后肝癌细胞形态学改变光镜下观察发现处理前的细胞呈多角形，核大．药理处理5d后见细胞大小趋于均匀，形态趋于规则，核浆比例降低，增殖分裂减慢。2．25-脱氧杂氮胞苷处理后肝癌细胞生长速度药物处理后的细胞生长速度减慢HePG2略明显(图1，2)。图1SMMC-7721细胞经5-脱氧杂氮胞苷处理前后的生长曲线图2HcpG2细胞经5-脱氧杂氮胞苷处理前后的生长曲线．2．3肝癌细胞经5-脱氧杂氮胞苷处理后细胞周期、凋亡率、P16蛋白表达的变化流式细胞仪分析显示药物处理后，5MMC-7721细胞，G1期细胞增加了3．5％，而S期和G2/M期细胞分别减少了47．8％和10．6％，可以看出5-脱氧杂氮胞苷可能将SMMC-772l细胞阻滞于细胞周期的G1期．HePG2细胞，G1期细胞增加了3．5％，S期减少了46．2％，G2／M期增加了31％，这提示5-脱氧杂氮胞苷可能将通过G0／G1期而进入S期的HePG2细胞阻滞于G2／M期，从而导致DNA合成期(S期)细胞含量相对下降，而G2／M期细胞含量相对上升的现象．两细胞凋亡率分别增加了91．4％和123．1％，说明5-脱氧杂氮胞苷具有诱导凋亡的作用．P16蛋白表达分别增加了13．4％和20．9％．如下表所示，5-脱氧杂氮胞苷处理后肝癌细胞的变化，细胞周期阻滞于Gl期，凋亡细胞率增高，P16蛋白表达上升(表1)．表1流式细胞仪测定2．45-脱氧杂氮胞苷处理后肝癌细胞甲基转移酶、P16mRNA表达量的变化经药物处理后两细胞株甲基转移酶的mRNA均明显降低(图3，4)，P16mRNA增多(图5，6)．2．55-脱氧杂氮胞苷处理后肝癌细胞棵鼠致瘤性实验结果实验显示，对照侧于1WK后均长出肿瘤，而实验侧于1wk后只有1只长出，2wk后另2只亦长出．连续观察4wk,实验侧肿瘤较对照侧生长慢，体积小(图7)．图35-脱氧杂氮胞苷处理前后SMMC-772l细胞株甲基转移酶mRNA的表达．图45-脱氧杂氮胞苷处理前后HePG2细胞株甲基转移酶mRNA的表达。图55-脱氧杂氮胞苷处理前后SMMC-7721细胞p16mRNA的表达。图65-脱氧杂氮胞苷处理前后HePG2细胞p16mRNA的表达。图75-脱氧杂氮胞苷处理SMMC-7721细胞的裸鼠致瘤性分析右侧接种经药处理的细胞，左侧接种对照组细胞。3讨论DNA甲基化是基因复制后修饰，也是一种新的基因调控机制，许多研究表明，肿瘤的发生与DNA甲基化异常有关，肿瘤细胞DNA甲基化异常现象主要表现为DNA广泛的低甲基化和区域性的高甲基化共存于一种组织，以及总的甲基化能力增加，从而导致与细胞生长分化有密切关系的癌基因激活和抗癌基因失活[7]，而且DNA甲基化异常的程度与肿瘤的恶性程度，进展程度及转移能力及预后均有关[4,5,8]．DNA甲基转移酶的主要功能是催化甲基基因与胞嘧啶环的结合，高的DNA甲基转移酶及其活性可通过DNA高甲基化参与肿瘤的形成[5]．P165'端CpG岛高甲基化所引起的p16失活是人类肿瘤中最频繁发生的基因改变[3，4，6]．本结果显示，肝癌细胞株SMMC-7721和HePG2经5-脱氧杂氮胞苷处理后，细胞生长受到抑制，裸鼠致瘤性也明显降低，进一步研究发现其甲基转移酶mRNA表达降低，p16mRNA、蛋白表达均增高，说明5-脱氧杂氮胞苷处理后肝癌细胞生长抑制和恶性程度降低是因为5-脱氧杂氮胞苷抑制了甲基转移酶，诱导因高甲基化而处于静止状态的基因重新表达，尤其是抑癌基因p16的表达，提示高甲基化状态及p16基因失活在肝癌的发生发展中起重要作用．当然，绝非仅仅p16抑癌基因，如肖文华etal[8,9]，在以往的研究中发现肝癌中17P13．3位点CpG岛、PYNZ22．1基因CpG位点及Rh基因存在异常高甲基化，因此，5-脱氧杂氮胞苷的去甲基化作用是否也恢复了这些抑癌基因的的功能，尚待进一步研究。在肿瘤的发生发展中甲基转移酶增高及活性增强，所起的作用至少有以下3种：①可导致区域性高甲基化，进而引起染色体结构改变，包括染色体臂的断裂缺失[10，11]；②肿瘤抑制基因及其相关基因的启动区域高甲基化引起转录静止[3，12]；③CpG位点C→T及相应的G→A转化突变可能因甲基转移酶的增高而加快，因此，有人称甲基转移酶为一种内源性致突变因素[3-15]，肿瘤的发生与多种基因的多种突变有关，而5-脱氧杂氮胞苷只能使那些因高甲基化转录受抑而尚未发生突变、缺失的基因恢复活性，因此，它在肿瘤治疗领域的价值有待进一步探讨。

　　作者简介：刘丽华，女，1968年10月27日出生，甘肃省白银市人，汉族。1990年第四军医大学医疗系毕业，1997年第三军医大学硕士，主治医师，主要从事消化系统疾病的研究，发表论文3篇。

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收稿日期：1999-11-16