实验性肝癌超声波热疗中热剂量和疗效关系的研究

肝胆胰外科杂志 2000年第3期第12卷 实验研究

作者：赵洪　蔡端　张延龄　张群华　陈亚珠

单位：赵洪　蔡端　张延龄　张群华（上海华山医院普外科，上海　200040）；陈亚珠（上海交通大学）

关键词：超声波；温热疗法；肝肿瘤

　　［摘　要］　目的: 比较不同热剂量的超声波对肝癌鼠的治疗作用，探讨在超声波热疗中达到有效热剂量的重要性。方法:以频率为3.5MHz的超声波分别照射荷人肝癌(LC)裸鼠和荷鼠肝癌(腹水型)昆明鼠，取不同的设定温度和持续时间，测量肿瘤的体积并绘制体积-时间曲线。两周后处死动物，肿瘤标本作病理学检查。结果:和对照组比较，治疗剂量组（43℃，30分钟）肿瘤体积从照射后的第三天起呈下降趋势，光镜下可见癌细胞排列紊乱，伴大量凝固性坏死；而小剂量组（41℃，12分钟）肿瘤体积呈上升趋势，光镜下见癌细胞巢状分布，癌巢间纤维组织增生。结论:热剂量在超声波热疗中应被看作是一极其关键的因素，热剂量过小反可能促进肿瘤的生长。

　　［中图分类号］　R454.5;R735.7［文献标识码］　A［文章编号］　1007-1954(2000)03-0149-03

The relationship between thermal dosage and experimental efficiency in the ultrasound hyperthermia of liver cancer

ZHAO Hong^*,CAI Duan,ZHANG Yan-ling,et al.

　　Huashan Hospital,Shanghai 200040

　　Abstract：　Objective： To explore the effects of ultrasound hyperthermia of different thermal dosage on primary liver cancer implanted in nude mices and KM mices.Methods： A 3.5MHz transducer was used to irradiate two kinds of liver cancer animal models with different temperature and duration respectively, the volume of tumors was measured daily and then curves of tumor volume correlative with time were obtained, the experimental animals were sacrificed 2 weeks after treatment, with the tumor tissues examined histologically.Results： Tumor in large-dose group（43℃，30′） showed a tendency of decreased tumor volume with arrangement disturbance of cancer cell and coagulation necrosis of large area, where as the volume of tumor in low-dose group（41℃，12′） began to increase on the third day after ultrasound exposure, with nest distribution of cancer cell and fiber hyperplasia in stromaConclusion： Thermal dosage should be regarded as a key factor during ultrasound hyperthermia,whereas too low thermal dose might promote the growth of malignant tumor to some extent.

　　Key words：　 ultrasound；hyperthermia；liver tumor

　　肿瘤热疗作为近几十年快速发展起来的一项较新的肿瘤临床治疗技术，已被公认为在21世纪极有发展潜力的肿瘤辅助治疗手段。 在超声波热疗的实验和临床研究中，首先面临着两个问题：①是否所有病理类型的肿瘤都对超声波热疗敏感?② 是否任何剂量的超声波均能对肿瘤细胞产生同一效应，热疗是否有可能在一定程度上促进肿瘤的生长?本实验通过比较两种不同剂量的超声热疗对人肝癌模型（LC）和鼠肝癌模型（腹水型）的作用，旨在探讨超声热疗中达到标准治疗热剂量的重要性。

　　1　材料和方法

　　1.1　实验仪器和实验动物

　　1.1.1　平面多元阵列超声加热治癌系统：上海交通大学生命科学院研制。 输出功率：20～40瓦特/单元格，单元格面积为3.6cm×3.6cm。 输出功率分5个电位档控制，各档中通过调整占空比来控制输出功率。通过数字PID系统，实时监测靶区温度，调节输出功率，使靶区温度平稳。

　　1.1.2　实验动物：均由中科院药物所提供。①荷人肝癌（LC）裸小鼠，雄性, 共30只， 5周周龄,体重18～22g；肿瘤接种期20天。肿瘤接种部位:右前肢腋旁靠近背侧。②荷鼠肝癌(腹水型)昆明鼠，雄性，共30只，体重18～20g，肿瘤接种期8天，肿瘤接种部位:右前肢腋旁靠近背侧。

　　1.2　实验方法

　　1.2.1　裸小鼠经编号后通过随机表分为:① 对照组，10只，不予超声波照射。②治疗剂量组，10只，予治疗剂量（43℃，30分钟）超声波处理。③ 小剂量组，10只，予低于治疗剂量（41℃，12分钟）的超声波处理。昆明鼠的分组方法同裸小鼠。

　　1.2.2　超声波热疗：将动物用高粘性电工胶带固定在自制的固定槽内，充分暴露肿瘤，将热电偶测温针经肿瘤周围的皮肤插入肿瘤中心，在受照射区域的皮肤上涂抹导声膏，导声膏的厚度＞5mm，将超声波换能器水囊垂直置于其上。超声波的频 率 设 定 在 3.5MHz。治疗剂量组：肿瘤中心上限温度设定在43℃，保持肿瘤中心温度大于42.5℃的时间达30分钟；小剂量组：肿瘤中心上限温度设定在41℃，照射时间12分钟。两组均每日照射一次, 共连续照射5次。照射期内每次治疗前30分钟、照射结束后的观察期内每天上午测量肿瘤的长径、短径并予记录。第19天（照射结束后的第14天）断颈处死动物，切取、剥离肿瘤标本，10%甲醛固定，作病理学检查。

　　1.3　数据处理　数据以平均值±标准差表示，小剂量组和对照组的组间差异：分别取各组第1天和第19天肿瘤体积的差数作t检验统计。

　　肿瘤体积计算公式 V=πab2/6(V—体积, a—肿瘤长径, b—肿瘤短径)

　　抑瘤率 = (对照组肿瘤体积－治疗组肿瘤体积)/ 对照组肿瘤体积

　　肿瘤增减=（照射前肿瘤体积－照射后肿瘤体积）/照射前肿瘤体积

　　2　结果

　　2.1　热疗后荷人肝癌（LC）裸小鼠肿瘤体积的变化　①治疗剂量组：在超声波照射的2～3天内所有肿瘤（10/10）体积明显增大，其长径和短径分别较照射前增大15%左右，并超出同期的对照组。第4天肿瘤开始缩小至照射前的水平，第15～16天时肿瘤平均体积达最低值0.08cm³，第19天时平均体积为0.12cm³。平均抑瘤率为91%。②对照组：肿瘤体积一直在缓慢上升，直至第14天其趋势才趋于平缓，第19天时平均体积为1.33 cm³。③小剂量组：肿瘤体积也在缓慢上升，第4～5天时其增长速度明显加快，并超出对照组，第16天起达峰值2.24cm³。

表1　 照射前及照射后荷人肝癌裸小鼠肿瘤体积(n均为10)

　　小剂量组与对照组比较:** P＜0.012.2　热疗后荷鼠肝癌(腹水型)昆明小鼠肿瘤体积的变化　①治疗剂量组：在超声波照射的3天内多数肿瘤（7/10）体积明显增大，第4天起肿瘤开始缩小至照射前的水平，第13～15天时肿瘤平均体积达最低值0.04 cm³，第19天时肿瘤的平均体积为0.06cm³。平均抑瘤率为96%。②小剂量组：在热疗的初期肿瘤体积缓慢上升，第6天时其增长速度明显加快，并超出对照组，第19天达2.7cm³。③对照组：肿瘤体积一直在缓慢上升，直至第15天其趋势才趋于平缓，第19天时肿瘤平均体积达1.72 cm³。

表2　 照射前及照射后荷鼠肝癌昆明鼠肿瘤体积(n均为10)

　　小剂量组与对照组比较:** P＜0.012.3　病理学检查

　　2.3.1　大体标本：大剂量治疗组的肿瘤标本多显椭圆形，组织较硬；小剂量组标本形态多不规则，较松软，中心坏死区域较明显；对照组的形态和质地介于上述两组之间。三组中肿瘤组织和周围组织分界清。

　　2.3.2　组织学观察：小剂量组和对照组肝癌细胞呈巢状分布，膨胀型生长。癌巢间纤维组织增生，癌细胞核大，染色质疏松，有明显核仁。胞浆丰富，略嗜碱性。癌细胞间见少量血窦，肿瘤组织中见片状坏死区，以肿瘤中心尤为明显。大剂量治疗组：癌细胞排列紊乱，伴大量凝固性坏死，可见核固缩，核碎裂，及核溶解。与周围组织分界尚清楚，坏死中央残存少量癌细胞小岛。

　　3　讨论

　　3.1　超声波热疗对肿瘤细胞的影响　肿瘤组织血管网发育不良，其血流量仅为周围组织的10%左右^［1］ 。肿瘤组织受高热时，血管内皮细胞损伤，肿瘤组织的血流供应明显下降^［2］，同时肿瘤内血管的生成受到抑制^［3］。热疗时，肿瘤组织氧分压显著下降，大量酸性代谢物聚集使肿瘤细胞内的pH值下降，从而肿瘤对热的敏感性增加^［4］；同时高温使肿瘤细胞中与DNA结合的蛋白质损伤^［5］，进而使参与DNA复制与修复的重要酶系统以及膜中的酶复合体破坏，肿瘤细胞因严重损伤而死亡。超声波在加热组织时除了上述的热学机制外，还存在着机械机制（每秒钟100万次以上的机械振动），在这样高频变化的力学环境中的组织细胞会发生一系列结构功能的改变，如细胞溶解、DNA降解、变性等。由于超声热疗是通过多种机制治疗肿瘤，故其疗效较单纯的热疗为好。

　　3.2　热疗后肿瘤体积的变化　热疗后2周左右，治疗剂量组较对照组肿瘤体积明显缩小，但在热疗的前3天肿瘤略微增大，这可能是由于肿瘤组织受超声波照射后，局部组织损伤、毛细血管的通透性增加，引起组织水肿，同时肿瘤血管内膜细胞受热损伤后水肿、膨胀导致动静脉血流比例失调及肿瘤细胞膜受损、钠泵失调、细胞水肿^［6］。肿瘤经3～4次热疗后，超声波对肿瘤组织的破坏开始起主导作用，肿瘤体积缩小至第一次辐射前的大小，在热疗2周后所采集的治疗剂量治疗组肿瘤标本的横截面上，显示肿瘤中心区域的大片坏死，经HE 染色处理后，镜下见大量细胞体积缩小，核浓缩的细胞及坏死细胞，和高功率聚焦超声的处理结果不同，本实验显示坏死组织和存活组织间无明显、锐利的分界线。热疗后16天左右，治疗剂量组的肿瘤体积出现回升。可能热疗中未受到致命损伤而仅受到抑制的肿瘤细胞的自我修复及“复活”所致。其确切机制有待于进一步研究探讨。

　　3.3　不同热剂量的超声热疗对肿瘤的影响　除大多数实验证实的超声波对肿瘤的破坏作用外，也有实验显示超声波照射可促进肿瘤的生长。有人用频率为3.0MHz，功率为1.0W/cm²的超声波连续10次照射肿瘤，发现肿瘤生长加快^［7］。在离体肿瘤细胞实验中发现0.5W/cm²和1.0W/cm² 的超声波能抑制Ehrlich腹水瘤细胞的DNA合成，而0.1W/cm² 的超声波则能刺激DNA的合成^［8］。在其他方式的热疗中发现中等温度的加热可增加肿瘤的血流，改善肿瘤细胞的氧合，如41.5℃的温热可明显提高A/J小鼠SCK乳腺肿瘤和C₃H小鼠Fsall纤维肉瘤的氧分压^［9］，而38.5～41.5℃的热水浴可改善C3H乳腺癌模型肿瘤细胞的氧合状态^［10］。从裸鼠和昆明鼠两组实验来看，治疗剂量的超声波对肿瘤起到抑制作用，而低剂量的超声波反而促进肿瘤的生长。这可能是由于低热剂量的超声波未能使肿瘤局部加热至有效治疗温度，从而未对肿瘤细胞产生致命的损伤，其温热效应和机械效应在某种程度上反而激活了肿瘤细胞，且低剂量的加热改善了肿瘤细胞的氧合状态，使之代谢旺盛或易于脱落并向周边浸润。因此超声波可从正面或负面影响肿瘤的生长，热剂量决定最终治疗结果，其具体表现为靶区的温度和维持该温度的时间，和超声波的频率无关。实践证实，肿瘤中心42～43℃引起肿瘤血管关闭，形成热量积蓄，同时增加了环境的酸度，扩大了肿瘤的生物热敏性。因此42～43℃是温热选择性作用于肿瘤细胞的关键温度^［11］，只要热疗时能达到规定的治疗热剂量，即能产生对肿瘤明显的抑制作用和杀伤效应。

　　3.4　超声波热疗对两种不同肿瘤的影响　虽然裸鼠种植瘤的肿瘤细胞类型和人肝癌细胞相同，但由于裸鼠为双重免疫缺陷的动物，其并不能完全模拟免疫功能相对健全的肝癌病人对超声热疗的反应，因此本实验又选用了免疫功能健全的荷鼠肝癌昆明鼠。超声热疗对两种不同动物、不同肿瘤的相同的治疗效果，更有力地证实了其疗效和量效关系。

　　作者简介：赵洪(1966-)，男，浙江人，主治医师，在职博士研究生。

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收稿日期：2000-02-15