携带tk基因的EB病毒复制子表达载体对人肝癌细胞的转导、杀伤和旁观者效应
中华实验外科杂志 1999年第6期第16卷 肝癌外科
作者:孙晓毅 吴在德 胡俊波 朱惠芬 沈关心
单位:孙晓毅 吴在德 胡俊波 430030 武汉,同济医科大学附属同济医院外科;朱惠芬 沈关心 同济医科大学实验中心免疫室
关键词: 癌,肝细胞;基因治疗;tk基因
【摘要】 目的 研究携带tk基因EB病毒复制子表达载体对人肝癌细胞的转导、杀伤和旁观者效应。方法 设更昔洛韦(GCV)组、阿昔洛韦(ACV)组和对照组共3组,脂质体包裹质粒转染人肝癌细胞后分别加入不同浓度药物;已转染基因的细胞与未转染的细胞不同比例混合,每孔分别加入GCV。样本72小时后MTT比色法检测杀伤和旁观者效应。结果 GCV或ACV均在0.2μmol/L浓度即可对转染tk基因的肝癌细胞产生杀伤作用并依浓度呈梯度变化。GCV在转染/未转染肝癌细胞1∶5的混合比率时即可产生明显的旁观者效应。结论 EB病毒复制子载体适合携带tk自杀基因用于肝癌基因治疗。
An EBV-based replicon expression vector carrying tk gene transfer into hepatocellular carcinoma cell line and its killing and bystander effect
Sun Xiaoyi, Wu Zaide, Hu Junbo, et al.
Department of Surgery, Tongji Hospital, Tongji Medical University, Wuhan 430030
【Abstract】 Objective To study the induction of sensitivity to Ganciclovir (GCV) or Acyclovir (ACV) in human hepatocellular carcinoma (HCC) cell line transferred by an EBV-based replicon expression vector carrying HSV-tk gene, including killing and “bystander” effect.Methods Liposome-entrapped plasmid pDR2/tk was transferred into HCC cells, and then different concentrations of GCV or ACV were added into each well. The transferred cells were mixed with untransferred HCC cells in different proposition and 200 μmol/L GCV was then added into each well. After 72 h all samples were measured by using MTT colorimetric assay.Results GCV or ACV could kill apparently the transferred HCC cells at a concentration of 0.2 μmol/L. Inhibition rate was changed with the different drug concentrations. “Bystander” effect could be obviously induced in the mixed ratio of 1:5 of transferred/untransferred HCC cells.Conclusion EBV-based vector is suitable for carrying suicide gene in gene therapy for hepatocellular carcinoma.
【Key words】 Hepatocellular carcinoma Gene therapy HSV-tk Gene
我们通过本研究对一种新构建的携带tk基因质粒型EB病毒复制子表达载体(pDR2/tk)转染人肝癌细胞后对更昔洛韦(GCV)和阿昔洛韦(ACV)的敏感性(包括杀伤作用和“旁观者效应”)进行检测,对其临床应用价值进行初步探讨,现报道如下。
材料与方法
1. 材料 表达载体pDR2/tk在中国预防医学科学院病毒所国家重点实验室构建。它由EB病毒改建tk基因片段取自pHSV-106。脂质体(Lipofectin Reagnt)购自Gibco公司。GCV和ACV购自湖北省医药工业研究所。人肝癌细胞系(SMMC-7721)由本校实验中心免疫研究室保存并提供。工具酶、RPMI-1640培养液、小牛血清为Gibco产品,四甲基偶氮唑盐(MTT)购自Sigma公司。
2. 方法 pDR2/tk的扩增、抽提、纯化和酶切鉴定按Sambrook的分子克隆方法进行。冻存肝癌细胞系SMMC-7721复苏并于37℃,体积分数为5%CO2培养箱中传代培养,培养液RPMI1640含青霉素100U/ml,链霉素100mg/L及体积分数为15%小牛血清。达到实验所需细胞数量后将细胞稀释成0.5×105个/ml,分转24孔培养板培养24小时后备转染。每孔转染液配制:10μg质粒DNA和Lipofectin 10μl加入无血清无抗生素RPMI 1640培养液至总量200μl。设GCV、ACV和对照共3组,每组分设6孔。转染:每孔去除原培养液后加入1ml新鲜无血清无抗生素RPMI 1640培养液,再加入200μl上述转染液,培养24小时后更换完全培养液。加药:3组各孔按6~1序号分别加入0、0.2、2、20、200、2000μmol/L的GCV或ACV(对照组加入GCV),每日更换加药条件培养液,并在倒置显微镜下观察细胞生长情况。“旁观者效应”:按上述方法行细胞培养和基因转染,24小时后去除转染液,将转染细胞浓度调至0.5×105个/ml,与同浓度未转染细胞按1∶5、2∶5、3∶5、4∶5和5∶5的比例混合,分别接种于6孔板,并设未转染细胞对照孔,每孔2ml细胞液。各孔均加入200μmol/L的GCV,37℃、体积分数为5%CO2培养。每日更换条件培养液及GCV。所有样本于72小时后进行MTT检测。
3. MTT比色法检测[1] 培养细胞0.25%胰蛋白酶液消化并使其混悬。将细胞悬液转至96孔板,每孔分转3复孔。离心去除上清液,每孔加入浓度为1g/L的MTT 100μl,37℃培养4小时后去除上清液,每孔加入二甲亚砜(DMSO)200μl,置微板振荡器使MTT结晶完全溶解后上DG3022A型酶标仪,选择570nm测各孔细胞培养液OD值,并计算生长抑制百分率:生长抑制率(%)=A-B/A×100%(A:未加药对照孔细胞培养液OD570nm值,B:加ACV或GCV孔细胞培养液OD570nm值)。
结果
1. 酶切鉴定 质粒用EcorV酶切可得10.85和1.52kb共2个片段;用Pst I酶切得6.99、1.9、1.66和1.21kb共4个片段,与原基因图及酶切图对照,表明质粒及tk基因插入正确。
2. 形态学变化 加药72小时后GCV和ACV各孔细胞形态改变依浓度呈梯度变化,在低药浓度孔肝癌细胞原有的梭形外观和相互融合的形态消失,细胞缩小呈圆形及不规则形。高药浓度孔仅见碎裂的细胞残屑。对照组各孔细胞生长良好,无形态改变。
3. MTT检测 GCV和ACV组MTT检测的OD570nm值均呈明显的梯度变化(表1),对照组无此种改变,计算存活率变化如图1。“旁观者效应”:GCV对不同混合比率的转染/未转染肝癌细胞均可产生效应,在1∶5的混合比例时即可表现出明显的抑制作用。
表1 MTT比色法检测转染TK基因人肝癌细胞对GCV和ACV敏感性的OD570nm值(μmol/L, ±s)
组别 |
0 |
0.2 |
2 |
20 |
200 |
2000 |
GCV |
1.303±0.060 |
1.057±
0.050** |
1.053±
0.070** |
0.987±
0.020**△ |
0.797±
0.050**△△ |
0.543±
0.020** |
ACV |
1.380±
0.090 |
1.200±
0.130* |
1.020±
0.070** |
0.677±
0.140* * |
0.513±
0.050** |
0.533±
0.060** |
对照组 |
1.347±
0.150 |
1.437±
0.030 |
1.493±
0.330 |
1.360±0.190 |
1.330±0.180 |
1.353±0.120 |
注: 与对照组相比*P<0.05;**P<0.01;与ACV组相比ΔP<0.05,ΔΔP<0.01.
图1 MTT法检测转染tk基因人肝癌细胞应用GCV和ACV后的存活率
讨论
本实验结果证实,GCV和ACV浓度为0.2μmol/L均可对转染tk基因的人肝癌细胞表现出抑制作用,GCV要强于ACV。在2000μmol/L浓度GCV的抑制作用也大于ACV。转染tk基因和未转染tk基因的细胞混合培养时,GCV不仅杀伤tk+细胞而且也杀伤tk-细胞,这种现象被称为“旁观者效应”。在我们的实验中,采用200μmol/L浓度的GCV在2∶5的混合比例即可表现出明显的“旁观者效应”。它的意义在于,只需少量肿瘤细胞被转染自杀基因,就会对临近肿瘤细胞产生广泛的杀伤作用,因而具有很大的抗肿瘤应用价值。
我们在本研究中采用由EB病毒改造的复制子型pDR2载体,它含有EB病毒质粒型复制必需的起顺式作用起始区ori P和反式蛋白EBNA-1编码区段,转染后不嵌入宿主染色体基因组,只在染色体外以稳定附加子形式存在并自主复制,故无将外源性病毒基因组导入而引起突变和感染的危险。这种载体为原核/真核细胞穿梭质粒,可在大肠杆菌中扩增,制备方便,是一种较理想的外源基因载体[2]。参考文献
1 Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytoxicity assays. J Immunol Methods, 1983,65:55-63.
2 颜子颖,乔健,贡惠宇,等.能在肝癌细胞特异性表达的自主复制型肝导向基因转移系统.中国科学(C辑),1997,27:341-346.
(收稿:1998-12-04 修回:1999-09-10)