胃癌组织中端粒酶活性的检测^△

　　中国医学科学院学报1999年第21卷第4期

高峰　张伟　金顺钱　刘毅　曲平　王洪平　张保宁

　　摘　要　目的　检测中国人胃癌组织及相应癌旁组织中的端粒酶活性，探讨将其作为胃癌肿瘤标志物的可能性。方法　采用以PCR为基础的TRAP(telomere repeat amplification protocol)方法检测了42例胃癌组织、42例相应癌旁组织及1例胃溃疡伴肠上皮化生及轻度不典型增生组织中的端粒酶活性表达。结果　42例胃癌组织中，37例显示端粒酶活性表达阳性，阳性率为88.1%；而在42例相应癌旁组织中，仅有2例显示端粒酶活性表达阳性，1例胃溃疡伴肠上皮化生及轻度不典型增生组织端粒酶活性表达阳性。结论　以上结果提示端粒酶检测有可能成为胃癌辅助性诊断手段。

　　关键词：胃癌　端粒酶

　　胃癌是最常见的恶性肿瘤之一，在我国肿瘤发病率中居第二位。由于胃癌早期临床表现无特异性，中晚期疗效不佳，预后差，因此提高早期胃癌的诊断水平是提高胃癌疗效及预后的关键。但是目前尚缺乏一种恒定、可靠、特异性强的检测方法。研究表明，端粒酶活化在细胞癌变中具有重要作用^［1］。由于端粒酶的活化，细胞得以无限增殖，最终导致癌的发生。胃癌端粒酶活性的研究国外已有报道^［2］。本研究采用以PCR为基础的TRAP(telomere repeat amplification protocol)^［3］方法对中国人胃癌组织及癌旁组织中端粒酶活性进行检测，旨在探讨端粒酶在胃癌中的表达情况及其临床意义。

　　1　材料和方法

　　标本来源　42例胃癌组织标本、42例相应癌旁组织(手术切缘)标本及1例胃溃疡伴肠上皮化生和轻度不典型增生组织标本均取自我院1996年11月至1997年10月间手术切除标本。标本均于手术切除肿瘤后30 min内采集，-80℃冰箱贮存备用，所有病例均经病理检查确诊。

　　端粒酶提取　每例标本取100 mg组织，用液氮在研钵中研成粉末，转至1.5 ml试管中，用冷洗液［10 mmol/L Hepes-KOH (pH7.5)、 1.5 mmol/L MgCl₂、10 mmol/L KCl、1 mmol/L DTT］洗涤后，加入200 μl预冷的裂解液［10 mM Tris-HCl(pH7.5)、1 mmol/L MgCl₂、1 mmol/L EGTA、5 mmol/L二巯基乙醇、0.5% CHAPS、10%甘油］，在0℃裂解30 min，13 500 r/min 4℃离心30 min，吸取上清至一新预冷管中，置于-80℃冰箱冻存待测。采用BCA试剂盒(Sigma公司产品)测定蛋白质含量。

　　端粒酶活性检测　采用TRAP法检测端粒酶活性^［3］。反应体积25 μl，反应体系含20 mmol/L Tris-HCl(pH 8.3)、1 mmol/L MgCl₂、63 mmol/L KCl、0.005% Tween-20、1 mmol/L EGTA、50 mmol/L dNTP、 1 μg T4基因32蛋白、0.1 μg BSA、74 kBq［α³²P］-dCTP、2U Taq酶和0.1 μg TS引物(5′-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3′)，加端粒酶提取物6 μg, 混匀后于30℃保温30 min。90℃ 90 s灭活端粒酶后，加0.1 μg CX引物(5′-CCCTTACCCTTACCCTTACCCTAA-3′)。混匀后覆盖石蜡油，在PE480 PCR仪上进行31周循环，循环参数： 90℃ 40 s, 50℃ 40 s，72℃ 50 s, 72℃延伸 10 min。PCR产物经10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离、放射自显影12 h后显示结果。每次检测以6 μg肺癌细胞系GLC蛋白提取物为阳性对照，阴性对照在反应液中不加组织提取物。出现3条以上显影带者判为阳性。

　　统计学处理　采用Χ²检验。

　　2　结果

　　胃癌及癌旁组织中端粒酶活性的表达　阳性对照标本经放射自显影后可见间隔6 bp的梯形带(附图)。42例胃癌组织中，有37例端粒酶活性表达阳性，阳性率为88.1%；42例癌旁组织中，有2例端粒酶活性表达阳性，阳性率为4.8%；两组相比差异有显著性意义(P＜0.001)。1例术前上消化道造影诊断为胃癌，术后病理证实为胃溃疡伴肠上皮化生及轻度不典型增生者端粒酶活性表达呈阳性。

附图　端粒酶在胃癌组织中的活性表达

　　Fig　Telomerase activity in gastric cancer tissues

　　P. lung cancer cell line GLC as positive control; N. normal tissue adjacent to the tumor; T. tumor; L. lysis buffer as negative control

　　胃癌组织中端粒酶活性表达与临床资料间关系　根据胃癌浸润深度、肿瘤大小、有无淋巴结转移、分化程度、临床分期等的不同进行分组统计，结果显示，以上各组端粒酶活性表达的差异均无显著性意义(P＞0.05)。

　　3　讨论

　　端粒酶是一种核糖核蛋白，主要由RNA和蛋白质组成，它能以自身RNA片段作为模板合成端粒，从而保持端粒长度。端粒长度的维持，可使细胞获得无限增殖的能力，而无限增殖是细胞癌变的重要生物学特性。1994年Counter等^［4］在卵巢癌中发现端粒酶活性表达阳性，而正常组织中缺乏端粒酶活性。目前已发现在大多数恶性肿瘤中端粒酶活性表达增高，如乳腺癌(88%)、肝癌(86%)、胰腺癌(95%)、结、直肠癌(89%)、膀胱癌(92%)等，而在正常人体组织中除生殖细胞、造血干细胞外均未检测到端粒酶活性表达^［5，6］。Hiyama等^［2］检测了66例胃癌组织标本发现，端粒酶活性表达阳性率为85%(56/66)，而癌旁组织端粒酶活性表达阳性率只有6%(4/66)。本实验检测了42例胃癌组织的端粒酶活性，阳性率为88.1%，癌旁组织端粒酶活性表达阳性率为4.8%，与国外报道一致。提示端粒酶活化可能在肿瘤发生发展中起关键作用，端粒酶活性表达有可能成为肿瘤分子的标志物。

　　端粒酶不仅在胃癌组织中呈活性表达，而且在部分良性及癌前病变中亦有表达，Tahara等^［7］检测了10例结、直肠管状腺瘤，结果表明端粒酶活性表达阳性率为100%；13例胃粘膜肠上皮化生中，3例(23%)端粒酶活性表达阳性；2例胃腺瘤中，1例(50%)端粒酶活性表达阳性。本研究检测的1例胃溃疡伴肠上皮化生及不典型增生组织，其端粒酶活性表达亦呈阳性。提示对于端粒酶活性表达阳性的良性病变及癌前病变进行研究有助于肿瘤的早期诊断，但其确切临床意义尚需扩大标本量做进一步的临床研究。

　　有文献报道端粒酶的活化可能与肿瘤的某些生物学行为有关。Hiyama等^［2］对胃癌的研究发现，胃癌中端粒酶活性表达阳性者其病灶较阴性者大，淋巴结转移率高，且晚期肿瘤端粒酶活性表达阳性率明显高于早期肿瘤，两组差异具有显著性(P＜0.05)。提示端粒酶活性检测可能对胃癌患者的预后预测提供参考依据。但本研究未发现胃癌端粒酶活性的表达与肿瘤浸润深度、肿瘤大小、淋巴结转移及临床分期有关(P＞0.05)。因此，端粒酶活性增高的临床意义有待更大规模样品的检测和前瞻性研究。

　　△中华医学基金(CMB)资助；*中国医学科学院肿瘤研究所肿瘤生物学检测中心，北京100021；#通讯作者

　　作者单位：中国医学科学院　中国协和医科大学　肿瘤医院腹部外科， 北京 100021

　　参考文献

　　1　Avilion AA, Piatyszek MA, Cupta J, et al. Human telomere RNA and telomerase activity in immortal cell lines and tumor tissues. Cancer Res, 1996, 56:645～648

　　2　Hiyama E, Yokoyama T, Tatsumoto N, et al. Telomerase activity in gastric cancer. Cancer Res, 1995, 55:3258～3262

　　3　Kim NW, Piatyszek MA, Prowse KR, et al. Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer. Science, 1994, 266:2011～2015

　　4　Counter CM, Hirte HW, Bacchetti S, et al. Telomerase activity in human ovarian carcinoma. Proc Natl Acad Sci USA, 1994, 91:2900～2904

　　5　Shay JW, Bacchetti S. A survey of telomerase activity in human cancer. Eur J Cancer, 1997, 33:787～791

　　6　Hiyama K, Hirai Y, Kyoizumi S, et al. Activation of telomerase in human lymphocytes and hematopoietic progenitor cell. J Immunol, 1995, 155:3711～3715

　　7　Tahara H, Kuniyasu H, Yokozaki H, et al. Telomerase activity in preneoplastic and neoplastic gastric and colorectal lesions. Clin Cancer Res, 1995, 1:1245～1251